劉 穎，王 可，何楊婷，肖金榮，王喚卓，李旸凱，魏 晟，*

（1．華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系環(huán)境與健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430030；2. 華 中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院胸外科，湖北 武漢 430030）

肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，且發(fā)病人數(shù)逐年上升[1-2]。作為肺癌的主要類型，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC) 占肺癌病例的85%~90%，肺鱗狀細(xì)胞癌(肺鱗癌)是NSCLC的主要類型[3]。全球每年約40萬人死于肺鱗癌。由于肺鱗癌易轉(zhuǎn)移和缺乏用于診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，肺鱗癌患者5年生存率不足15%[4]。改善肺癌患者的預(yù)后情況是提高肺癌病人生存率的關(guān)鍵因素[5-6]。因此，尋找與肺鱗癌預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物，通過生物標(biāo)志物對(duì)肺鱗癌患者的預(yù)后情況進(jìn)行早期評(píng)估，對(duì)提高肺鱗癌病人的預(yù)后及生存率非常重要。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是近年來才認(rèn)識(shí)到的一種具有重要調(diào)控功能的分子標(biāo)志物，其長(zhǎng)度大于200 nt且不具備編碼功能。當(dāng)前l(fā)ncRNA的功能仍在研究之中，但初步的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可通過促癌或抑癌作用，影響多種腫瘤細(xì)胞的增殖擴(kuò)散或凋亡過程[7-9]。分子標(biāo)簽(signature)是指將一定數(shù)量的分子標(biāo)記物進(jìn)行組合，形成一個(gè)新的變量，并用此變量來判斷或定義某些生物學(xué)特性。與單個(gè)標(biāo)記物的分子模式不同，分子標(biāo)簽不單以單基因功能為研究基礎(chǔ)，而且更加注重基因之間的共同協(xié)調(diào)作用，從整體和系統(tǒng)水平上對(duì)某種特定的生物學(xué)特性進(jìn)行描述[10]。腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(the Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)作為目前全球范圍內(nèi)最大的腫瘤公共數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)常見腫瘤提供了多種組學(xué)數(shù)據(jù)，是當(dāng)前研究腫瘤組學(xué)數(shù)據(jù)的重要來源[11]。本研究通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肺鱗癌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的挖掘，評(píng)估lncRNA表達(dá)水平對(duì)肺鱗癌病人進(jìn)行預(yù)后預(yù)測(cè)的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2017年12月從TCGA網(wǎng)站(https://cancergenome.nih.gov/)下載肺鱗癌病人癌和癌旁組織的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。RNA測(cè)序數(shù)據(jù)由肺鱗癌組織樣本通過Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序得到。下載的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)包含肺鱗癌病人496例癌組織的lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)以及48例癌旁組織的14 165個(gè)lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。肺鱗癌患者的臨床數(shù)據(jù)包括466例肺鱗癌的相關(guān)臨床信息，如性別、年齡、種族、病理分期、吸煙狀態(tài)、放療、化療情況及存活狀態(tài)等。

1.2 研究方法

1.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理 去除在肺鱗癌病人中生存時(shí)間顯示為0的患者以及表達(dá)值缺失超過5% 的lncRNA。最終有48例肺鱗癌病人癌組織和癌旁組織的3 921個(gè)lncRNA位點(diǎn)用于差異表達(dá)分析；用于預(yù)后分析的數(shù)據(jù)集包括443例肺鱗癌病人的lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。

1.2.2 差異表達(dá)分析和熱圖繪制 對(duì)48例肺鱗癌病人癌組織和癌旁組織的3 921個(gè)lncRNA進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，根據(jù)t檢驗(yàn)對(duì)應(yīng)的P值，采用BH法(Benjamini and Hochberg，1995)計(jì)算每個(gè)lncRNA的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discorvery rate，F(xiàn)DR)值[12]。同時(shí)計(jì)算癌和癌旁組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)水平的倍數(shù)變化(fold change)。本次研究確定lncRNA差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為FDR<0.05且倍數(shù)變化絕對(duì)值≥3[13]。其中，倍數(shù)變化≥3為lncRNA在肺鱗癌組織中表達(dá)水平上調(diào)，倍數(shù)變化≤1/3為lncRNA在肺鱗癌組織中表達(dá)水平下調(diào)。對(duì)篩選出的差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行非監(jiān)督聚類分析，并繪制熱圖(heatmap)。

1.2.3 lncRNA標(biāo)志物篩選 采用LASSO(Least Absolute Shrinkage and Selector Operation)Cox回歸進(jìn)行肺鱗癌預(yù)后相關(guān)lncRNA篩選。并通過LASSO Cox的系數(shù)構(gòu)建lncRNA分子標(biāo)簽。lncRNA分子標(biāo)簽=β1×EXPlncRNA1+β2×EXPlncRNA2+...+βn× EXPlncRNAn。 (EXP：lncRNA的表達(dá)水平，β：回歸相關(guān)系數(shù))。代入相關(guān)數(shù)據(jù)后，計(jì)算分子標(biāo)簽得分。分別通過lncRNA分子標(biāo)簽得分的中位數(shù)將肺鱗癌病人劃分為高表達(dá)組和低表達(dá)組；lncRNA分子標(biāo)簽得分的四分位數(shù)將肺鱗癌病人劃分為4組。計(jì)算不同風(fēng)險(xiǎn)組病人發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)及95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)。

1.2.4 構(gòu)建預(yù)測(cè)模型 在lncRNA分子標(biāo)簽的基礎(chǔ)上加入相關(guān)臨床變量，如年齡、性別、種族、吸煙情況、放療情況、化療情況和臨床病理分期，構(gòu)建關(guān)于肺鱗癌預(yù)后的預(yù)測(cè)模型，并用Harrell’s C統(tǒng)計(jì)量對(duì)預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)效果進(jìn)行評(píng)估，C統(tǒng)計(jì)量的范圍在0.50~0.70時(shí)說明預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性一般，當(dāng)C統(tǒng)計(jì)量大于0.70時(shí)說明預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性較優(yōu)[14-15]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SAS 9.4軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用R 3.3.0軟件和GraPad- Prism 5軟件進(jìn)行相關(guān)圖形制作。連續(xù)性資料表示為x±s。運(yùn)用t檢驗(yàn)的方法比較兩樣本之間均數(shù)的差異情況。計(jì)數(shù)資料之間的差異性分析釆用χ2檢驗(yàn)或確切概率計(jì)算法。

2 結(jié) 果

2.1 納入對(duì)象基本情況

符合條件的肺鱗癌患者443人，其中男性患者死亡220人(73.33%)，未死亡108人(75.52%)；女性患者死亡80人(26.67%)，未死亡35人(24.48%)；肺鱗癌死亡患者平均年齡(66.9±8.5)歲，未死亡患者平均年齡(68.9±7.8)歲。種族、吸煙、放療、化療、生存時(shí)間等情況見表1。

表1 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中納入分析的肺鱗狀細(xì)胞癌患者的基本特征(n=443)

2.2 癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNA

對(duì)48例肺鱗癌病人癌和癌旁組織的lncRNA位點(diǎn)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，經(jīng)分析滿足條件FDR<0.05且倍數(shù)變化絕對(duì)值≥3的lncRNA共有322個(gè)，所有l(wèi)ncRNA在癌組織中均表達(dá)上調(diào)。對(duì)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析，結(jié)果以熱圖的形式呈現(xiàn)，圖中紅色表示癌組織，藍(lán)色表示癌旁組織，見圖1。

2.3 LASSO Cox回歸篩選與肺鱗癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA

在322個(gè)具有差異的lncRNA位點(diǎn)中，篩選出6個(gè)lncRNA進(jìn)入模型，分別為ENSG00000186615.9(KTN1-AS1)、 ENSG00000204949.7(FAM83A-AS1)、 ENSG000 00232855.5(AF131217.1)、ENSG00000258592.1(RP11-108M12.3)、 ENSG00000259230.1(CTD-2555C10.3)、ENSG00000278514.1(AC068831.16)。lncRNA在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因注釋信息以及經(jīng)LASSO Cox回歸分析得到的回歸系數(shù)和lncRNA在癌和癌旁組織中的倍數(shù)變化及FDR值情況見表2。肺鱗癌和癌旁組織中這些lncRNA表達(dá)情況見圖2。6個(gè)lncRNA均在癌組織中出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FDR<0.01)。

對(duì)LASSO Cox回歸篩選出的6個(gè)lncRNA及其系數(shù)構(gòu)建lncRNA分子標(biāo)簽，分子標(biāo)簽值計(jì)算公式為：

(EXP：基因表達(dá)水平)

表2 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出6個(gè)lncRNA的注釋信息及其在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況比較

2.4 lncRNA分子標(biāo)簽與肺鱗癌預(yù)后的關(guān)系

圖2 LASSO Cox回歸篩選出6個(gè)lncRNA在肺鱗癌癌旁組織和癌組織中的表達(dá)水平

表3 lncRNA分子標(biāo)簽與肺鱗癌預(yù)后之間的關(guān)系

采用Cox回歸分析方法，建立2個(gè)基于lncRNA分子標(biāo)簽的肺鱗癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型。模型1未調(diào)整變量，模型2調(diào)整年齡、性別、種族、吸煙狀態(tài)、化療情況、放療情況和病理分期變量。結(jié)果見表3。調(diào)整相應(yīng)臨床變量后，高表達(dá)組肺鱗癌病人的死亡風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)組病人的2.14倍，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=2.14，95%CI： 1.50~3.04，P<0.01)。當(dāng)根據(jù)分子標(biāo)簽表達(dá)水平的四等分點(diǎn)-0.15、-0.09、-0.04將肺鱗癌患者劃分為4組時(shí)，分子標(biāo)簽值位于下四分位數(shù)和中位數(shù)之間時(shí)，HR為1.62(95%CI：0.93~2.83，P=0.09)；分子標(biāo)簽值位于中位數(shù)與上四分位數(shù)之間時(shí)，HR為2.22(95%CI：1.33~3.70，P<0.01)；分子標(biāo)簽值大于上四分位 數(shù) 時(shí) ， HR為 3.30(95%CI： 1.98~5.50， P<0.01)；lncRNA分子標(biāo)簽的Kaplan Meier生存曲線如圖3所示，調(diào)整變量后隨著分子標(biāo)簽水平的升高，肺鱗癌病人發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)逐漸增加(P<0.01)。

2.5 lncRNA分子標(biāo)簽的預(yù)測(cè)模型對(duì)肺鱗癌病人預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

Cox生存分析結(jié)果顯示，單獨(dú)使用lncRNA分子標(biāo)簽進(jìn)行肺鱗癌病人預(yù)后狀況預(yù)測(cè)時(shí)，C統(tǒng)計(jì)量的結(jié)果為0.63(95%CI：0.58~0.69)。當(dāng)加入臨床變量年齡、性別、種族、吸煙、放療、化療、病理分期后，其預(yù)測(cè)模型的C統(tǒng)計(jì)量為0.69(95%CI：0.64~0.75)。兩者相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)。通過模型效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可以看出，當(dāng)在lncRNA分子標(biāo)簽的基礎(chǔ)上加入臨床變量構(gòu)建預(yù)后預(yù)測(cè)模型時(shí)，其預(yù)測(cè)效果進(jìn)一步優(yōu)化，表明包含lncRNA分子標(biāo)簽和臨床變量的預(yù)測(cè)模型可以對(duì)肺鱗癌病人的預(yù)后狀況進(jìn)行有效預(yù)測(cè)。

圖3 lncRNA分子標(biāo)簽表達(dá)水平不同的肺鱗癌病人的生存曲線比較

3 討 論

本研究采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中l(wèi)ncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)探討與肺鱗癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA標(biāo)志物。經(jīng)過差異表達(dá)分析及LASSO Cox回歸發(fā)現(xiàn)6個(gè)與肺鱗癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA位點(diǎn)并組成lncRNA分子標(biāo)簽，進(jìn)一步進(jìn)行臨床指標(biāo)的相關(guān)分析。結(jié)果顯示，隨著分子標(biāo)簽水平的升高，肺鱗癌病人發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)逐漸增加。當(dāng)根據(jù)lncRNA分子標(biāo)簽的中位數(shù)將人群分為高表達(dá)組和低表達(dá)組時(shí)，高表達(dá)組病人的死亡風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)組肺鱗癌病人2.14倍。當(dāng)調(diào)整了性別、年齡、吸煙狀態(tài)、種族、病理分期、化療情況、放療情況構(gòu)建預(yù)后預(yù)測(cè)模型后，其C統(tǒng)計(jì)量的結(jié)果增加至0.69。由以上結(jié)果可見，基于lncRNA分子標(biāo)簽的預(yù)測(cè)模型具有較為良好的效能，可以對(duì)肺鱗癌病人的預(yù)后狀況進(jìn)行有效預(yù)測(cè)。

本研究發(fā)現(xiàn)的6個(gè)lncRNA位點(diǎn)在包括肺鱗癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，在以往的研究中已經(jīng)有報(bào)道。lncRNA KTN1-AS1的高表達(dá)是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，且其參與構(gòu)建的3-lncRNA 標(biāo)志物能較好預(yù)測(cè)患者的生存情況[16]。lncRNA FAM83AAS1可通過促進(jìn)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮致癌作用，促使乳腺上皮等細(xì)胞癌變，也可通過激活EGFR下游傳導(dǎo)信號(hào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖侵襲和EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥，高表達(dá)預(yù)示乳腺癌預(yù)后不良[17-18]?；赥CGA數(shù)據(jù)庫(kù)的研究中，lncRNA RP11-108M12.3在肺鱗癌組是不良預(yù)后的保護(hù)因素，與本研究結(jié)果一致，且其參與構(gòu)建的5-lncRNA標(biāo)志物也具有獨(dú)立的預(yù)后價(jià)值[19]。LncRNA CTD-2555C10.3的高表達(dá)是肺腺癌的預(yù)后危險(xiǎn)因素，其參與構(gòu)建的7維轉(zhuǎn)錄組分子標(biāo)簽對(duì)肺腺癌預(yù)后有較好的指示作用[20]。

本次研究采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)在全基因組范圍內(nèi)挖掘肺鱗癌預(yù)后相關(guān)lncRNA，檢測(cè)方法一致，樣本量較大，可信度較高。首先，本研究采用LASSO Cox回歸的方法篩選肺鱗癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA標(biāo)志物，避免了樣本量遠(yuǎn)小于自變量帶來的多重共線性問題和減小了II類錯(cuò)誤。第二，本研究將單個(gè)lncRNA構(gòu)建分子標(biāo)簽，進(jìn)一步構(gòu)建lncRNA預(yù)測(cè)方程比單個(gè)lncRNA位點(diǎn)具有更好的預(yù)后預(yù)測(cè)效果。

當(dāng)然，本研究也存在一定的局限性：第一，本研究構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型僅考慮了lncRNA的表達(dá)，未考慮其他水平的生物標(biāo)志物對(duì)肺鱗癌病人預(yù)后的影響，如甲基化、以及DNA序列變異等，因此其應(yīng)用價(jià)值還有待進(jìn)一步的研究；第二，本研究中預(yù)測(cè)模型建立在美國(guó)肺鱗癌人群，但其在中國(guó)肺鱗癌人群中的預(yù)測(cè)效果如何仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，經(jīng)TCGA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘，篩選出lncRNA 分子標(biāo)簽及其和臨床變量構(gòu)建的預(yù)后預(yù)測(cè)模型對(duì)肺鱗癌預(yù)后有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，為肺鱗癌的臨床預(yù)后判斷提供了更多可供選擇的生物標(biāo)志物。