杜 娟，胡向陽，劉 丹，胡 衛(wèi)，陳 濤，*

（1. 三 峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2. 恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北恩施 445000）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，中國乳腺癌發(fā)病率增速居全球首位[1-2]。骨是乳腺癌轉(zhuǎn)移最常見的部位，70%的晚期乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[3-5]，對于大多數(shù)乳腺癌患者來說，骨轉(zhuǎn)移主要是溶骨性的，可導(dǎo)致嚴(yán)重疼痛和骨折[6]。此類患者常常選擇化療，但此方法毒副作用較大，預(yù)后較差，因此亟需一種能減輕患者痛苦、提高生活質(zhì)量的治療藥物。

近年來，中醫(yī)藥治療乳腺癌取得了顯著成效，在改善患者的生存質(zhì)量、延長生存期、控制病情發(fā)展等方面發(fā)揮了重要作用[7]。補(bǔ)腎壯骨方劑三骨湯由補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、透骨草按一定比例組成，已有研究證明其能控制惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[8]，其中透骨草所含生物堿成分在抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌等方面證實(shí)有一定的功效[9]。但其對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制尚未見報(bào)道，本研究旨在探討透骨草總生物堿(the total alkaloids of tougucao，TTAT)對人乳腺癌細(xì)胞所致溶骨性病變的影響，并對其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 TTAT的提取與鑒定

透骨草，購于湖北天濟(jì)中藥飲片公司，國藥準(zhǔn)字H45871202，批號20175687-541，每袋10 g。取透骨草500 g，粉碎得全草粉末后用80%乙醇回流提取3次，蒸發(fā)濃縮成浸膏，用1%鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH為2~3，抽濾，用氨水調(diào)節(jié)濾液pH至11~12，抽濾。得到的濾液用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯液，濃縮，得到透骨草總生物堿提取物。將提取物與配好的顯色劑(碘化鉍鉀試劑或改良碘化鉍鉀與碘化汞鉀試劑)反應(yīng)，觀察顏色結(jié)果[10-11]。

1.2 動物及裸鼠乳腺癌脛骨骨轉(zhuǎn)移模型的建立

成年健康BALB/c-nu雌性裸鼠，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物使用經(jīng)營許可證號為SCXK(京)2012-0001。造模前1周復(fù)蘇凍存在液氮中的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞(來源于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，并進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。用0.4%臺盼藍(lán)染色后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞活性，計(jì)數(shù)活細(xì)胞率>95%時收集細(xì)胞，用無菌PBS將細(xì)胞密度調(diào)整至1×107/mL，用10 μL微量進(jìn)樣器從裸鼠右后肢脛骨平臺刺入，向脛骨腔內(nèi)注射細(xì)胞懸液10 μL，用手輕捏進(jìn)針口2 min至針口閉合。

1.3 分組給藥及取材

鹽酸多柔比星粉劑(doxorubicin，DOX)，海正輝瑞制藥有限公司(中國)，國藥準(zhǔn)字H33021980，批號2017 482-4，每瓶10 mg；DOX是一種抗腫瘤抗生素，在臨床上常用于乳腺癌的化療，主要用來觀察透骨草總生物堿的抗腫瘤能力是否與常規(guī)化療藥效果一致[12]。唑來膦酸注射液(zoledronic acid，ZOL)，正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司(中國)，國藥準(zhǔn)字H20041346，批號845125-9875，每支5 mL，含4 mg；ZOL是一種作用于骨的特異性二磷酸化合物，它能抑制因破骨細(xì)胞活性增加而導(dǎo)致的骨吸收，主要用來觀察透骨草總生物堿抗乳腺癌骨質(zhì)破壞的能力[13]。

將42只裸鼠分為正常組(不予任何處理)、模型組(僅造模，不予其他處理)、TTAT低濃度組(100 mg/kg TTAT腹腔注射)、TTAT高濃度組(500 mg/kg TTAT腹腔注射)、DOX組(5 mg/kg DOX腹腔注射)、ZOL組(0.4 mg/kg ZOL頸后皮下注射)，每組7只。除正常組和模型組外，其余組造模1周成瘤后開始給藥，隔日1次。給藥期間，每周定期(1~2 d)觀察裸鼠生存狀態(tài)，并稱體質(zhì)量，計(jì)算腫瘤體積，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長、短徑，算出每組平均值。處死裸鼠后，剝離腫瘤組織，經(jīng)電子天平稱量瘤質(zhì)量，計(jì)算各組平均瘤質(zhì)量和平均腫瘤體積，最后計(jì)算抑瘤率。連續(xù)給藥6周。采用頸椎脫臼法處死各組裸鼠，以右側(cè)髖關(guān)節(jié)為界切除右后肢，取右后肢腫瘤組織放入-80 ℃冰箱保存待檢。

1.4 影像學(xué)技術(shù)及評分標(biāo)準(zhǔn)

以右側(cè)髖關(guān)節(jié)為界切除右后患肢，運(yùn)用TUC-4653P醫(yī)用X光診斷系統(tǒng)進(jìn)行X線攝片并評分，分析標(biāo)準(zhǔn)[14]如下：0分，正常骨性結(jié)構(gòu)，即無任何骨質(zhì)破壞征象；1分，脛骨注射部位附近見小的骨質(zhì)缺損灶(≤3個)；2分，髓質(zhì)骨缺損，病灶增多(>3個)；3分，髓質(zhì)骨缺失，同時皮質(zhì)骨受侵；4分，單面骨皮質(zhì)完全缺損；5分，雙面骨皮質(zhì)缺失，移位性骨折。由2位研究者分別計(jì)分，并計(jì)算平均值。

1.5 HE染色

脛骨標(biāo)本固定后轉(zhuǎn)入不同濃度的酒精進(jìn)行組織脫水，再將組織塊置于二甲苯中透明，常規(guī)石蠟包埋切片，切片包括骨組織及骨旁腫瘤組織。HE染色后在光鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個視野拍照。

1.6 破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)(TRAP染色)

脛骨標(biāo)本固定約24 h后轉(zhuǎn)入脫鈣液(10%甲醛+EDTA過飽和溶液)脫鈣8周，石蠟包埋切片，切片包括骨組織及骨旁腫瘤組織?？咕剖崴嵝粤姿崦?tartaric acid phosphatase staining，TRAP)染色后在光鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個視野拍照，計(jì)數(shù)，取平均值表示其破骨細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blot檢測裸鼠腫瘤組織中RANKL、OPG、p-ERK、ERK、p-JNK以及JNK的表達(dá)

取裸鼠骨轉(zhuǎn)移部位腫瘤組織，加裂解液提取組織蛋白質(zhì)，超聲裂解得蛋白上清液并記錄體積，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行組織蛋白定量。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(nitrocellulose filter membrane，NC)膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗：鼠抗β-actin(武漢博士德生物工程有限公司)稀釋比例為1∶500；兔多抗骨保護(hù)素(osteoprotegerin， OPG)和 兔 多 抗 核 因 子 -κB配 體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)(上海艾博抗貿(mào)易有限公司)，稀釋比例均為1∶200；兔單抗細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracelluar signal-regulated kinase，ERK)、p-ERK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p-JNK(美國CST公司)，稀釋比例均為1∶400，4 ℃過夜，TBST洗膜3次。加入相應(yīng)HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，稀釋比例為1∶500)，室溫作用2 h，TBST洗膜3次。用ECL Western blot化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色檢測，以β-actin為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料采用x±s表示，組間比較采用LSD法分析，應(yīng)用方差分析和t檢驗(yàn)。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 TTAT的提取和測定結(jié)果

提取得到透骨草總生物堿3.28 g，加入碘化鉍鉀試劑或改良碘化鉍鉀均產(chǎn)生橘紅色沉淀，加入碘化汞鉀試劑產(chǎn)生類白色沉淀，證明提取物中含有生物堿。

2.2 TTAT對裸鼠腫瘤生物學(xué)行為的影響

2.2.1 各組裸鼠腫瘤質(zhì)量及體積變化情況和抑瘤率與模型組比較，100和500 mg/kg TTAT處理組均可顯著抑制腫瘤生長(P<0.05)；與DOX 組比較，100 mg/kg TTAT劑量組腫瘤體積和瘤質(zhì)量增加即腫瘤抑瘤率降低(P<0.05)；500 mg/kg TTAT組上述指標(biāo)間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與ZOL組比較，上述2個TTAT劑量組的腫瘤體積和瘤質(zhì)量均下降即腫瘤抑瘤率明顯增加(P<0.05)，見表1。

表1 各組裸鼠腫瘤質(zhì)量及體積變化情況和抑瘤率對比(-x±s，n=7)

2.2.2 TTAT對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠骨質(zhì)破壞的影像學(xué)檢測 影像學(xué)評分顯示，與模型組比較，100和500 mg/kg TTAT均能夠明顯降低乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠右下肢骨質(zhì)破壞情況和影像學(xué)評分(P<0.05)。與DOX組比較，TTAT 500 mg/kg組能夠明顯降低乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠右下肢骨質(zhì)破壞況和影像學(xué)評分(P<0.05)。但100和500 mg/kg TTAT組對骨質(zhì)破壞及影像學(xué)評分的影響較ZOL組弱(P<0.05)，見圖1和表2。

表2 各 組裸鼠影像學(xué)評分 (-x±s，n=7)

圖1 TTAT對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠骨質(zhì)破壞的影像學(xué)檢測

2.2.3 各組乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠右下肢HE染色 HE染色結(jié)果顯示，模型組中腫瘤細(xì)胞密度高，核大深染，見病理核分裂像，異型性明顯，骨質(zhì)破壞明顯，呈溶骨性破壞。與模型組比較，100和500 mg/kg TTAT組中腫瘤細(xì)胞彌漫分布，排列較緊密，間質(zhì)增多，部分腫瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。與DOX組比較，500 mg/kg TTAT組中腫瘤細(xì)胞與之呈相同形態(tài)，異型性減輕，體積縮小，排列較松散，間質(zhì)增多，出現(xiàn)較多變性和壞死，但骨質(zhì)破壞比DOX組明顯減輕。與ZOL組比較，500 mg/kg TTAT組腫瘤細(xì)胞異型性明顯降低，彌漫分布，排列較緊密，間質(zhì)增多，部分腫瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，而骨質(zhì)破壞情況與之相當(dāng)，均較模型組明顯減輕。見圖2。

圖2 各組乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠右下肢HE染色

2.2.4 各組乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠右下肢TRAP染色及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù) TRAP染色結(jié)果顯示，骨組織及骨小梁呈淡黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，破骨細(xì)胞呈酒紅色，模型組可見明顯的骨破壞，且破骨細(xì)胞數(shù)量明顯多于其他各組(P<0.05)。與模型組比較，100和500 mg/kg TTAT組均能夠降低破骨細(xì)胞的數(shù)量(P<0.05)。與DOX組比較，500 mg/kg TTAT組能明顯降低破骨細(xì)胞的數(shù)量(P<0.05)。500 mg/kg TTAT組降低破骨細(xì)胞數(shù)量的能力與與ZOL組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。如圖3所示。

2.3 TTAT對OPG/RANKL/RANK信號通路的影響

圖3 各組乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠右下肢TRAP染色及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)

與模型組比較，100和500 mg/kg TTAT組均上調(diào)了OPG的表達(dá)，OPG/RANKL的比值升高(P<0.01)。與DOX比較，500 mg/kg TTAT組降低了RANKL的表達(dá)，OPG/RANKL的比值亦升高(P<0.05)。與ZOL比較，100和500 mg/kg組上調(diào)了RANKL的表達(dá)，OPG/RANKL的比值降低(P<0.05)，如圖4所示。

與模型組比較，100和500 mg/kg TTAT組均能降低ERK、JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。與DOX組比較，上述2個TTAT劑量組中p-ERK表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，500 m g/kg T TAT組中p-JNK的表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與ZOL組比較，500 m g/kg T TAT組中p-ERK、p-JNK的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，如圖5所示。

3 討 論

正常的骨代謝依靠破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成之間的動態(tài)平衡來維持。乳腺癌轉(zhuǎn)移至骨組織，可激活破骨細(xì)胞的活性，導(dǎo)致骨代謝失衡，骨組織被分解，致使骨質(zhì)吸收。有研究發(fā)現(xiàn)OPG、RANKL和RANK是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和骨吸收的重要因子[15-16]。

圖4 TTAT對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠OPG/RANKL比值的影響

圖5 TTAT對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠腫瘤轉(zhuǎn)移ERK、p-ERK、JNK和p-JNK蛋白表達(dá)的影響

RANKL能直接啟動破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程，維持破骨細(xì)胞活性[17]。破骨細(xì)胞表面的RANK是RANKL刺激破骨細(xì)胞分化、成熟的唯一靶受體[18-19]。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophagecolony stimulating factor，M-CSF)能夠促使破骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞接觸，使 RANK/RANKL經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑刺激破骨細(xì)胞活化[20]。OPG是一種分泌性可溶性蛋白[21]， 是RANKL誘騙受體[22]，可與RANKL競爭性結(jié)合，阻斷RANKL/RANK間的相互作用，使RANKL失去功能，從而抑制體內(nèi)及體外破骨細(xì)胞的分化，抑制成熟破骨細(xì)胞的活性，并誘導(dǎo)成熟破骨細(xì)胞的凋亡，從而起到減少骨吸收的作用[23-25]。因此，在破骨細(xì)胞分化成熟過程中OPG/RANKL比值起主要的調(diào)節(jié)作用[26-27]，也就是說OPG/RANKL系統(tǒng)在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移骨吸收和重建中起關(guān)鍵作用[28]。

RANKL主要由骨髓間質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌，破骨細(xì)胞不分泌RANKL[29]。有研究發(fā)現(xiàn)RANK能夠誘導(dǎo)RANK陽性的前列腺癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，證明RANKL具有趨化因子活性[30-32]。RANKL誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移與特殊的信號有關(guān)，特別是MAPKs通路(JNK和ERK)的激活，ERK和JNK是MAPK信號傳導(dǎo)通路中經(jīng)典的信號蛋白分子，MAPK是一類由脯氨酸介導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過Ⅷ區(qū)域蘇氨酸、酪氨酸雙位點(diǎn)磷酸化活化，激活的MAPK通過磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白、其他酶類等不同底物來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理過程，其中ERK主要通過Ras→Raf→MAPK/ERK激酶(MAPK/ERK kinase，MEK) 被激活，可能與生理性信號傳導(dǎo)有關(guān)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，有利于損傷的修復(fù)和細(xì)胞的再生，對破骨細(xì)胞的形成、生存、分化及刺激骨吸收有重要作用[33]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TTAT能顯著抑制裸鼠骨腫瘤的生長，抑制破骨細(xì)胞的分化，顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的胞質(zhì)ERK和JNK的磷酸化水平，在TTAT高濃度組這種抑制作用更加明顯。結(jié)果表明OPG/RANKL/RANK信號通路在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中起著重要作用，TTAT能夠通過上調(diào)OPG/RANKL的比值進(jìn)而調(diào)控其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和骨質(zhì)的破壞，由此可見抑制OPG/RANKL/RANK信號通路的表達(dá)可能成為減少腫瘤骨轉(zhuǎn)移的潛在方法之一，TTAT有望開發(fā)成為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的有效藥物。