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        氯喹通過激活P38MAPK通路誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡

        2018-12-07 03:16:04丁文評(píng)陸元元童文俠周藹斌陳意紅
        癌變·畸變·突變 2018年6期
        關(guān)鍵詞:氯喹貼壁細(xì)胞核

        丁文評(píng),陸元元,童文俠,周藹斌,孔 祥,陳意紅,*

        (1.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院放療科,安徽 蕪湖241001;2.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院內(nèi)分泌科,安徽 蕪湖 241001)

        肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常見的消化道腫瘤之一,其惡性程度高,嚴(yán)重威脅人類健康。根據(jù)2012年癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年肝癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)到78.2萬,而我國(guó)的肝癌新發(fā)病例數(shù)為39.5萬,約占全球發(fā)病例數(shù)的一半[1-2]。目前,手術(shù)是肝癌的主要治療手段,介入、化療和靶向藥物等治療手段是重要的補(bǔ)充。但多數(shù)患者肝癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中晚期,治療效果欠佳。因此,肝癌的治療仍是難題,探尋新的藥物顯得尤為迫切。但研發(fā)新藥耗時(shí)長(zhǎng),價(jià)格昂貴,若以“老藥”為基礎(chǔ)探索其潛在的抗腫瘤機(jī)制,將其變成抗腫瘤“新藥”,則可為腫瘤治療帶來新的思路[3]。

        氯喹(chloroquine,CQ)既往廣泛應(yīng)用于瘧疾、炎癥和病毒感染性疾病的治療[4-6],近年來,由于其抗腫瘤作用備受學(xué)者關(guān)注。目前,氯喹的抗腫瘤機(jī)制大多集中在其對(duì)自噬(autophagy)的抑制作用,從而使腫瘤細(xì)胞難以抵抗不利環(huán)境[7]。有研究表明,氯喹可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8],但氯喹抗腫瘤的具體作用機(jī)制尚不清楚。P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogenactivated protein kinase,P38MAPK)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,本研究將氯喹作用于肝癌細(xì)胞株后觀察細(xì)胞凋亡情況和P38MAPK蛋白表達(dá)的變化,初步探討其可能的機(jī)制,為肝癌的治療提供新方法。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料和細(xì)胞

        人肝細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;氯喹和四甲基噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)粉劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(均溶解于PBS溶液);DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清和胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;鼠抗人P-P53、Bcl-2和Bax抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;兔抗人P38MAPK、P-P38MAPK和Caspase-3抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino- 2-phenylindole,DAPI)染色液、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、鼠抗人Actin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體均購(gòu)自中國(guó)碧云天公司;ECL超敏發(fā)光液和PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞,并置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度培養(yǎng)箱中,隔天傳代1次,選擇呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將HepG2細(xì)胞接種于96孔板中,接種細(xì)胞密度為5×104/mL,待細(xì)胞過夜貼壁后加藥,分為空白組(僅含DMEM培養(yǎng)基,不含細(xì)胞)、對(duì)照組(加等體積PBS)和實(shí)驗(yàn)組(氯喹終濃度分別為10、20和40 μmol/L)。加藥繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后,加入0.5%的MTT溶液10 μL,作用4 h后,再加10%的SDS溶液150 μL,室溫下溶解過夜,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度D(562)值,計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

        1.2.3 DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種到24孔板中,接種細(xì)胞密度為2×105/mL,過夜貼壁后,分別向細(xì)胞中加入不同濃度(0、10、20和40 μmol/L)的氯喹,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛固定后,進(jìn)行DAPI 熒光染色,于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化。

        1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將HepG2細(xì)胞接種到6 cm培養(yǎng)皿中,接種細(xì)胞密度為2×105/mL,待過夜貼壁后,分別加入不同濃度(0、10、20和40 μmol/L)氯喹,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集全部細(xì)胞(包括懸浮和貼壁的細(xì)胞),調(diào)整細(xì)胞懸液至1×106/mL后,按凋亡試劑盒步驟分別加入Annexin V和PI染料后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè),統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果判斷:無染色細(xì)胞(左下象限,Q4)為正常細(xì)胞;Annexin V單染(右下象限,Q3)為早期凋亡細(xì)胞;PI單染(左上象限,Q1)為細(xì)胞碎片;Annexin V和PI雙染(右上象限Q2)為晚期凋亡細(xì)胞。

        1.2.5 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 將HepG2細(xì)胞接種到6 c m培養(yǎng)皿中,接種細(xì)胞密度為2×105/mL,待過夜貼壁后,加入不同濃度(0、10、20和40 μmol/L)氯喹,24 h后提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解物蛋白濃度。每組取50 μg蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠中電泳,再濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,常溫下脫脂奶粉封閉后,分別加入一抗溶液(Actin,1∶2 000;P-P53、Bcl-2、Bax、P38MAPK、P-P38MAPK 和Caspase-3均為1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。洗膜后,滴加相應(yīng)的二抗溶液(HRP標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠抗體)室溫下孵育1 h 。洗膜后加入ECL超敏發(fā)光液后顯影。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        2 結(jié) 果

        2.1 氯喹對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

        MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。當(dāng)用不同濃度(10、20和40 μ mol/L)氯喹處理HepG2細(xì)胞時(shí),24 h 后10 μ mol/L氯喹對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用不明顯(P>0.05);當(dāng)氯喹濃度增加到 20和40 μmol/L時(shí),對(duì)細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用(P<0.05);當(dāng)處理HepG2細(xì)胞48和72 h后,10~ 40 μmol/L氯喹對(duì)細(xì)胞均有明顯抑制作用(P<0.05),見圖1。

        2.2 氯喹對(duì)HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響

        在熒光倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組肝癌細(xì)胞核完整,呈均勻微弱的淡藍(lán)色熒光,細(xì)胞核固縮少見(圖2A);當(dāng)氯喹作用細(xì)胞后,細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、致密的強(qiáng)藍(lán)色熒光,提示細(xì)胞發(fā)生凋亡,并隨著藥物濃度的增加,這種含固縮、緊密藍(lán)色熒光的細(xì)胞核逐漸增加,提示凋亡細(xì)胞數(shù)增加(圖2B~D)。

        圖1 氯喹對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

        圖2 氯喹對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響(×200)

        2.3 氯喹對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

        用不同濃度氯喹處理HepG2細(xì)胞24 h后,流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凋亡分析的結(jié)果見圖3。對(duì)照組凋亡率 (2.51± 0.63)%, 10、 20和 40 μmol/L氯 喹 實(shí) 驗(yàn) 組HepG2 細(xì) 胞 凋 亡 率 分 別 是(5.58±1.14)%、 (9.21±0.97)%和(22.54+2.53)%,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率隨著氯喹濃度的增加而增加,較對(duì)照組均明顯升高,差異具均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

        圖3 氯喹對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞凋亡的影響

        2.4 氯喹對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

        Western blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況,如圖4所示。當(dāng)氯喹處理細(xì)胞24 h后,Caspase-3蛋白的表達(dá)量未發(fā)生明顯變化,但其剪切后活化型Caspase-3的表達(dá)量上升(圖4A)。隨著氯喹濃度的升高,促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量逐漸增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量降低(圖4B)。

        2.5 氯喹對(duì)HepG2細(xì)胞P38MAPK通路蛋白表達(dá)的影響

        用氯喹處理HepG2細(xì)胞24 h后,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞中P38MAPK蛋白均無明顯增加;而在20和40 μmol/L氯喹處理時(shí),磷酸化的P38MAPK和磷酸化的P53蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(圖5)。

        3 討 論

        圖4 氯喹對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

        圖5 氯喹對(duì)HepG2細(xì)胞P38MAPK通路蛋白表達(dá)的影響

        氯喹作為經(jīng)典的抗瘧藥物還廣泛應(yīng)用于病毒感染、自身免疫系統(tǒng)疾病和癌癥等疾病上[9-10]。研究表明,氯喹可改變?nèi)苊阁w內(nèi)的pH值從而阻斷了自噬作用發(fā)揮抗腫瘤作用,因?yàn)樽允煽梢詭椭[瘤細(xì)胞抵抗不良生存環(huán)境以及放化療[11-14]。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)氯喹的抗腫瘤作用機(jī)制還涉及誘導(dǎo)凋亡、腫瘤干細(xì)胞的清除和促進(jìn)腫瘤血管正常化等[15-16]。目前有少量文獻(xiàn)報(bào)道氯喹可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡和引起細(xì)胞周期阻滯,其機(jī)制可能與Caspase活化和 miRNA調(diào)控等有關(guān)[8,17-18]。但氯喹在肝癌中的抗腫瘤機(jī)制仍不明確,需要我們進(jìn)一步探索和證實(shí)。本研究中,為明確氯喹的抗腫瘤作用,我們通過體外實(shí)驗(yàn)觀察了氯喹對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2增殖的影響。我們發(fā)現(xiàn)氯喹可抑制其生長(zhǎng),并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,隨著藥物濃度的增加,這種作用更加明顯。

        絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinases,MAPKs)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它們?cè)诩?xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[19]。P38MAPK也稱為 RK或 CSBP,它是酵母HOG激酶的哺乳動(dòng)物同源基因,作為MAPKs家族中重要的組成部分,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān),它主要通過調(diào)控下游多種酶及轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)活性發(fā)揮生物細(xì)胞學(xué)效應(yīng)[20]。有研究表明,在諸如化學(xué)藥物、紫外線、射線和細(xì)胞因子等外界因素的刺激下,P38MAPK信號(hào)通路能被激活并加速細(xì)胞的凋亡[21]。我們研究發(fā)現(xiàn),氯喹可引起磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)增加,而磷酸化P38MAPK是發(fā)揮生物學(xué)作用的活化狀態(tài),可磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡。作為P38MAPK下游的P53基因被稱為明星抑癌基因,其激活的方式是以蛋白的磷酸化實(shí)現(xiàn),磷酸化后的P53可通過引發(fā)細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡等來抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[22]。而Bcl-2家族和Caspase家族與P53介導(dǎo)的凋亡有關(guān)[23]。Bax基因發(fā)揮促凋亡作用,而Bcl-2則發(fā)揮相反作用。Caspase蛋白作為細(xì)胞凋亡的功能執(zhí)行者,在凋亡后期發(fā)揮重要作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn),氯喹作用肝癌細(xì)胞后,磷酸化的P53蛋白表達(dá)增加,活化型Caspase-3的表達(dá)量顯著上升,Bax的表達(dá)量增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量卻降低。這說明,P38MAPK可通過活化P53后調(diào)控Bax、Bcl-2和Caspase-3等誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

        綜上所述,氯喹可能是通過激活P38MAPK來活化下游凋亡信號(hào)通路,促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡。然而氯喹是直接作用于P38MAPK信號(hào)分子還是通過調(diào)節(jié)其上游信號(hào)分子發(fā)揮作用仍不清楚,尚需進(jìn)行更深入的研究和探索。

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