丁文評，陸元元，童文俠，周藹斌，孔 祥，陳意紅，*

（1．皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院放療科，安徽 蕪湖241001；2．皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽 蕪湖 241001）

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的消化道腫瘤之一，其惡性程度高，嚴重威脅人類健康。根據(jù)2012年癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全球每年肝癌新發(fā)病例數(shù)達到78.2萬，而我國的肝癌新發(fā)病例數(shù)為39.5萬，約占全球發(fā)病例數(shù)的一半[1-2]。目前，手術(shù)是肝癌的主要治療手段，介入、化療和靶向藥物等治療手段是重要的補充。但多數(shù)患者肝癌發(fā)現(xiàn)時已屬中晚期，治療效果欠佳。因此，肝癌的治療仍是難題，探尋新的藥物顯得尤為迫切。但研發(fā)新藥耗時長，價格昂貴，若以“老藥”為基礎(chǔ)探索其潛在的抗腫瘤機制，將其變成抗腫瘤“新藥”，則可為腫瘤治療帶來新的思路[3]。

氯喹(chloroquine，CQ)既往廣泛應(yīng)用于瘧疾、炎癥和病毒感染性疾病的治療[4-6]，近年來，由于其抗腫瘤作用備受學者關(guān)注。目前，氯喹的抗腫瘤機制大多集中在其對自噬(autophagy)的抑制作用，從而使腫瘤細胞難以抵抗不利環(huán)境[7]。有研究表明，氯喹可抑制肝癌細胞的增殖和誘導細胞凋亡[8]，但氯喹抗腫瘤的具體作用機制尚不清楚。P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogenactivated protein kinase，P38MAPK)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，本研究將氯喹作用于肝癌細胞株后觀察細胞凋亡情況和P38MAPK蛋白表達的變化，初步探討其可能的機制，為肝癌的治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料和細胞

人肝細胞株HepG2購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；氯喹和四甲基噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)粉劑購自美國Sigma公司(均溶解于PBS溶液)；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；鼠抗人P-P53、Bcl-2和Bax抗體均購自美國Santa Cruz公司；兔抗人P38MAPK、P-P38MAPK和Caspase-3抗體均購自美國Cell Signaling公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino- 2-phenylindole，DAPI)染色液、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、鼠抗人Actin抗體、HRP標記的山羊抗兔抗體和HRP標記的山羊抗小鼠抗體均購自中國碧云天公司；ECL超敏發(fā)光液和PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細胞，并置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度培養(yǎng)箱中，隔天傳代1次，選擇呈對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖情況 將HepG2細胞接種于96孔板中，接種細胞密度為5×104/mL，待細胞過夜貼壁后加藥，分為空白組(僅含DMEM培養(yǎng)基，不含細胞)、對照組(加等體積PBS)和實驗組(氯喹終濃度分別為10、20和40 μmol/L)。加藥繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，加入0.5%的MTT溶液10 μL，作用4 h后，再加10%的SDS溶液150 μL，室溫下溶解過夜，用酶標儀檢測各孔吸光度D(562)值，計算細胞相對存活率。

1.2.3 DAPI染色觀察細胞核形態(tài)變化 取對數(shù)生長期的HepG2細胞接種到24孔板中，接種細胞密度為2×105/mL，過夜貼壁后，分別向細胞中加入不同濃度(0、10、20和40 μmol/L)的氯喹，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛固定后，進行DAPI 熒光染色，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)學變化。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 將HepG2細胞接種到6 cm培養(yǎng)皿中，接種細胞密度為2×105/mL，待過夜貼壁后，分別加入不同濃度(0、10、20和40 μmol/L)氯喹，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集全部細胞(包括懸浮和貼壁的細胞)，調(diào)整細胞懸液至1×106/mL后，按凋亡試劑盒步驟分別加入Annexin V和PI染料后在流式細胞儀上檢測，統(tǒng)計細胞凋亡率。結(jié)果判斷：無染色細胞(左下象限，Q4)為正常細胞；Annexin V單染(右下象限，Q3)為早期凋亡細胞；PI單染(左上象限，Q1)為細胞碎片；Annexin V和PI雙染(右上象限Q2)為晚期凋亡細胞。

1.2.5 Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達 將HepG2細胞接種到6 c m培養(yǎng)皿中，接種細胞密度為2×105/mL，待過夜貼壁后，加入不同濃度(0、10、20和40 μmol/L)氯喹，24 h后提取細胞總蛋白，BCA法測定細胞裂解物蛋白濃度。每組取50 μg蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠中電泳，再濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，常溫下脫脂奶粉封閉后，分別加入一抗溶液(Actin，1∶2 000；P-P53、Bcl-2、Bax、P38MAPK、P-P38MAPK 和Caspase-3均為1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。洗膜后，滴加相應(yīng)的二抗溶液(HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠抗體)室溫下孵育1 h 。洗膜后加入ECL超敏發(fā)光液后顯影。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 氯喹對HepG2細胞增殖的影響

MTT實驗結(jié)果如圖1所示。當用不同濃度(10、20和40 μ mol/L)氯喹處理HepG2細胞時，24 h 后10 μ mol/L氯喹對HepG2細胞增殖抑制作用不明顯(P>0.05)；當氯喹濃度增加到 20和40 μmol/L時，對細胞增殖均有明顯抑制作用(P<0.05)；當處理HepG2細胞48和72 h后，10~ 40 μmol/L氯喹對細胞均有明顯抑制作用(P<0.05)，見圖1。

2.2 氯喹對HepG2細胞核形態(tài)的影響

在熒光倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組肝癌細胞核完整，呈均勻微弱的淡藍色熒光，細胞核固縮少見(圖2A)；當氯喹作用細胞后，細胞核出現(xiàn)固縮、致密的強藍色熒光，提示細胞發(fā)生凋亡，并隨著藥物濃度的增加，這種含固縮、緊密藍色熒光的細胞核逐漸增加，提示凋亡細胞數(shù)增加(圖2B~D)。

圖1 氯喹對人肝癌HepG2細胞增殖能力的影響

圖2 氯喹對人肝癌細胞HepG2細胞核形態(tài)的影響(×200)

2.3 氯喹對HepG2細胞凋亡的影響

用不同濃度氯喹處理HepG2細胞24 h后，流式細胞儀對細胞進行凋亡分析的結(jié)果見圖3。對照組凋亡率 (2.51± 0.63)%， 10、 20和 40 μmol/L氯 喹 實 驗 組HepG2 細 胞 凋 亡 率 分 別 是(5.58±1.14)%、 (9.21±0.97)%和(22.54+2.53)%，實驗組細胞凋亡率隨著氯喹濃度的增加而增加，較對照組均明顯升高，差異具均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。

圖3 氯喹對人肝癌細胞HepG2細胞凋亡的影響

2.4 氯喹對HepG2細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot檢測HepG2細胞中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達情況，如圖4所示。當氯喹處理細胞24 h后，Caspase-3蛋白的表達量未發(fā)生明顯變化，但其剪切后活化型Caspase-3的表達量上升(圖4A)。隨著氯喹濃度的升高，促凋亡蛋白Bax的表達量逐漸增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量降低(圖4B)。

2.5 氯喹對HepG2細胞P38MAPK通路蛋白表達的影響

用氯喹處理HepG2細胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，細胞中P38MAPK蛋白均無明顯增加；而在20和40 μmol/L氯喹處理時，磷酸化的P38MAPK和磷酸化的P53蛋白的表達水平均顯著升高(圖5)。

3 討 論

圖4 氯喹對HepG2細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖5 氯喹對HepG2細胞P38MAPK通路蛋白表達的影響

氯喹作為經(jīng)典的抗瘧藥物還廣泛應(yīng)用于病毒感染、自身免疫系統(tǒng)疾病和癌癥等疾病上[9-10]。研究表明，氯喹可改變?nèi)苊阁w內(nèi)的pH值從而阻斷了自噬作用發(fā)揮抗腫瘤作用，因為自噬可以幫助腫瘤細胞抵抗不良生存環(huán)境以及放化療[11-14]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)氯喹的抗腫瘤作用機制還涉及誘導凋亡、腫瘤干細胞的清除和促進腫瘤血管正常化等[15-16]。目前有少量文獻報道氯喹可誘導肝癌細胞的凋亡和引起細胞周期阻滯，其機制可能與Caspase活化和 miRNA調(diào)控等有關(guān)[8，17-18]。但氯喹在肝癌中的抗腫瘤機制仍不明確，需要我們進一步探索和證實。本研究中，為明確氯喹的抗腫瘤作用，我們通過體外實驗觀察了氯喹對肝癌細胞株HepG2增殖的影響。我們發(fā)現(xiàn)氯喹可抑制其生長，并能誘導細胞凋亡，隨著藥物濃度的增加，這種作用更加明顯。

絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinases，MAPKs)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它們在細胞的增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[19]。P38MAPK也稱為 RK或 CSBP，它是酵母HOG激酶的哺乳動物同源基因，作為MAPKs家族中重要的組成部分，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，它主要通過調(diào)控下游多種酶及轉(zhuǎn)錄因子的基因表達活性發(fā)揮生物細胞學效應(yīng)[20]。有研究表明，在諸如化學藥物、紫外線、射線和細胞因子等外界因素的刺激下，P38MAPK信號通路能被激活并加速細胞的凋亡[21]。我們研究發(fā)現(xiàn)，氯喹可引起磷酸化P38MAPK蛋白表達增加，而磷酸化P38MAPK是發(fā)揮生物學作用的活化狀態(tài)，可磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡。作為P38MAPK下游的P53基因被稱為明星抑癌基因，其激活的方式是以蛋白的磷酸化實現(xiàn)，磷酸化后的P53可通過引發(fā)細胞周期阻滯和誘導凋亡等來抑制腫瘤細胞的生長[22]。而Bcl-2家族和Caspase家族與P53介導的凋亡有關(guān)[23]。Bax基因發(fā)揮促凋亡作用，而Bcl-2則發(fā)揮相反作用。Caspase蛋白作為細胞凋亡的功能執(zhí)行者，在凋亡后期發(fā)揮重要作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，氯喹作用肝癌細胞后，磷酸化的P53蛋白表達增加，活化型Caspase-3的表達量顯著上升，Bax的表達量增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量卻降低。這說明，P38MAPK可通過活化P53后調(diào)控Bax、Bcl-2和Caspase-3等誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，氯喹可能是通過激活P38MAPK來活化下游凋亡信號通路，促進肝癌HepG2細胞的凋亡。然而氯喹是直接作用于P38MAPK信號分子還是通過調(diào)節(jié)其上游信號分子發(fā)揮作用仍不清楚，尚需進行更深入的研究和探索。