丁文評，陸元元，童文俠，周藹斌，孔 祥，陳意紅，*

（1．皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院放療科，安徽 蕪湖241001；2．皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽 蕪湖 241001）

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的消化道腫瘤之一，其惡性程度高，嚴(yán)重威脅人類健康。根據(jù)2012年癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全球每年肝癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)到78.2萬，而我國的肝癌新發(fā)病例數(shù)為39.5萬，約占全球發(fā)病例數(shù)的一半[1-2]。目前，手術(shù)是肝癌的主要治療手段，介入、化療和靶向藥物等治療手段是重要的補充。但多數(shù)患者肝癌發(fā)現(xiàn)時已屬中晚期，治療效果欠佳。因此，肝癌的治療仍是難題，探尋新的藥物顯得尤為迫切。但研發(fā)新藥耗時長，價格昂貴，若以“老藥”為基礎(chǔ)探索其潛在的抗腫瘤機(jī)制，將其變成抗腫瘤“新藥”，則可為腫瘤治療帶來新的思路[3]。

氯喹(chloroquine，CQ)既往廣泛應(yīng)用于瘧疾、炎癥和病毒感染性疾病的治療[4-6]，近年來，由于其抗腫瘤作用備受學(xué)者關(guān)注。目前，氯喹的抗腫瘤機(jī)制大多集中在其對自噬(autophagy)的抑制作用，從而使腫瘤細(xì)胞難以抵抗不利環(huán)境[7]。有研究表明，氯喹可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]，但氯喹抗腫瘤的具體作用機(jī)制尚不清楚。P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogenactivated protein kinase，P38MAPK)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，本研究將氯喹作用于肝癌細(xì)胞株后觀察細(xì)胞凋亡情況和P38MAPK蛋白表達(dá)的變化，初步探討其可能的機(jī)制，為肝癌的治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料和細(xì)胞

人肝細(xì)胞株HepG2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；氯喹和四甲基噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)粉劑購自美國Sigma公司(均溶解于PBS溶液)；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；鼠抗人P-P53、Bcl-2和Bax抗體均購自美國Santa Cruz公司；兔抗人P38MAPK、P-P38MAPK和Caspase-3抗體均購自美國Cell Signaling公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino- 2-phenylindole，DAPI)染色液、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、鼠抗人Actin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體均購自中國碧云天公司；ECL超敏發(fā)光液和PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，并置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度培養(yǎng)箱中，隔天傳代1次，選擇呈對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 將HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，接種細(xì)胞密度為5×104/mL，待細(xì)胞過夜貼壁后加藥，分為空白組(僅含DMEM培養(yǎng)基，不含細(xì)胞)、對照組(加等體積PBS)和實驗組(氯喹終濃度分別為10、20和40 μmol/L)。加藥繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，加入0.5%的MTT溶液10 μL，作用4 h后，再加10%的SDS溶液150 μL，室溫下溶解過夜，用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度D(562)值，計算細(xì)胞相對存活率。

1.2.3 DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種到24孔板中，接種細(xì)胞密度為2×105/mL，過夜貼壁后，分別向細(xì)胞中加入不同濃度(0、10、20和40 μmol/L)的氯喹，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行DAPI 熒光染色，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 將HepG2細(xì)胞接種到6 cm培養(yǎng)皿中，接種細(xì)胞密度為2×105/mL，待過夜貼壁后，分別加入不同濃度(0、10、20和40 μmol/L)氯喹，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集全部細(xì)胞(包括懸浮和貼壁的細(xì)胞)，調(diào)整細(xì)胞懸液至1×106/mL后，按凋亡試劑盒步驟分別加入Annexin V和PI染料后在流式細(xì)胞儀上檢測，統(tǒng)計細(xì)胞凋亡率。結(jié)果判斷：無染色細(xì)胞(左下象限，Q4)為正常細(xì)胞；Annexin V單染(右下象限，Q3)為早期凋亡細(xì)胞；PI單染(左上象限，Q1)為細(xì)胞碎片；Annexin V和PI雙染(右上象限Q2)為晚期凋亡細(xì)胞。

1.2.5 Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 將HepG2細(xì)胞接種到6 c m培養(yǎng)皿中，接種細(xì)胞密度為2×105/mL，待過夜貼壁后，加入不同濃度(0、10、20和40 μmol/L)氯喹，24 h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定細(xì)胞裂解物蛋白濃度。每組取50 μg蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠中電泳，再濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，常溫下脫脂奶粉封閉后，分別加入一抗溶液(Actin，1∶2 000；P-P53、Bcl-2、Bax、P38MAPK、P-P38MAPK 和Caspase-3均為1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。洗膜后，滴加相應(yīng)的二抗溶液(HRP標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠抗體)室溫下孵育1 h 。洗膜后加入ECL超敏發(fā)光液后顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 氯喹對HepG2細(xì)胞增殖的影響

MTT實驗結(jié)果如圖1所示。當(dāng)用不同濃度(10、20和40 μ mol/L)氯喹處理HepG2細(xì)胞時，24 h 后10 μ mol/L氯喹對HepG2細(xì)胞增殖抑制作用不明顯(P>0.05)；當(dāng)氯喹濃度增加到 20和40 μmol/L時，對細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用(P<0.05)；當(dāng)處理HepG2細(xì)胞48和72 h后，10~ 40 μmol/L氯喹對細(xì)胞均有明顯抑制作用(P<0.05)，見圖1。

2.2 氯喹對HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響

在熒光倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組肝癌細(xì)胞核完整，呈均勻微弱的淡藍(lán)色熒光，細(xì)胞核固縮少見(圖2A)；當(dāng)氯喹作用細(xì)胞后，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、致密的強藍(lán)色熒光，提示細(xì)胞發(fā)生凋亡，并隨著藥物濃度的增加，這種含固縮、緊密藍(lán)色熒光的細(xì)胞核逐漸增加，提示凋亡細(xì)胞數(shù)增加(圖2B~D)。

圖1 氯喹對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

圖2 氯喹對人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響(×200)

2.3 氯喹對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

用不同濃度氯喹處理HepG2細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行凋亡分析的結(jié)果見圖3。對照組凋亡率 (2.51± 0.63)%， 10、 20和 40 μmol/L氯 喹 實 驗 組HepG2 細(xì) 胞 凋 亡 率 分 別 是(5.58±1.14)%、 (9.21±0.97)%和(22.54+2.53)%，實驗組細(xì)胞凋亡率隨著氯喹濃度的增加而增加，較對照組均明顯升高，差異具均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

圖3 氯喹對人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞凋亡的影響

2.4 氯喹對HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測HepG2細(xì)胞中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況，如圖4所示。當(dāng)氯喹處理細(xì)胞24 h后，Caspase-3蛋白的表達(dá)量未發(fā)生明顯變化，但其剪切后活化型Caspase-3的表達(dá)量上升(圖4A)。隨著氯喹濃度的升高，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量逐漸增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量降低(圖4B)。

2.5 氯喹對HepG2細(xì)胞P38MAPK通路蛋白表達(dá)的影響

用氯喹處理HepG2細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞中P38MAPK蛋白均無明顯增加；而在20和40 μmol/L氯喹處理時，磷酸化的P38MAPK和磷酸化的P53蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(圖5)。

3 討 論

圖4 氯喹對HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5 氯喹對HepG2細(xì)胞P38MAPK通路蛋白表達(dá)的影響

氯喹作為經(jīng)典的抗瘧藥物還廣泛應(yīng)用于病毒感染、自身免疫系統(tǒng)疾病和癌癥等疾病上[9-10]。研究表明，氯喹可改變?nèi)苊阁w內(nèi)的pH值從而阻斷了自噬作用發(fā)揮抗腫瘤作用，因為自噬可以幫助腫瘤細(xì)胞抵抗不良生存環(huán)境以及放化療[11-14]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)氯喹的抗腫瘤作用機(jī)制還涉及誘導(dǎo)凋亡、腫瘤干細(xì)胞的清除和促進(jìn)腫瘤血管正常化等[15-16]。目前有少量文獻(xiàn)報道氯喹可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡和引起細(xì)胞周期阻滯，其機(jī)制可能與Caspase活化和 miRNA調(diào)控等有關(guān)[8，17-18]。但氯喹在肝癌中的抗腫瘤機(jī)制仍不明確，需要我們進(jìn)一步探索和證實。本研究中，為明確氯喹的抗腫瘤作用，我們通過體外實驗觀察了氯喹對肝癌細(xì)胞株HepG2增殖的影響。我們發(fā)現(xiàn)氯喹可抑制其生長，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，隨著藥物濃度的增加，這種作用更加明顯。

絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinases，MAPKs)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它們在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[19]。P38MAPK也稱為 RK或 CSBP，它是酵母HOG激酶的哺乳動物同源基因，作為MAPKs家族中重要的組成部分，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，它主要通過調(diào)控下游多種酶及轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)活性發(fā)揮生物細(xì)胞學(xué)效應(yīng)[20]。有研究表明，在諸如化學(xué)藥物、紫外線、射線和細(xì)胞因子等外界因素的刺激下，P38MAPK信號通路能被激活并加速細(xì)胞的凋亡[21]。我們研究發(fā)現(xiàn)，氯喹可引起磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)增加，而磷酸化P38MAPK是發(fā)揮生物學(xué)作用的活化狀態(tài)，可磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡。作為P38MAPK下游的P53基因被稱為明星抑癌基因，其激活的方式是以蛋白的磷酸化實現(xiàn)，磷酸化后的P53可通過引發(fā)細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡等來抑制腫瘤細(xì)胞的生長[22]。而Bcl-2家族和Caspase家族與P53介導(dǎo)的凋亡有關(guān)[23]。Bax基因發(fā)揮促凋亡作用，而Bcl-2則發(fā)揮相反作用。Caspase蛋白作為細(xì)胞凋亡的功能執(zhí)行者，在凋亡后期發(fā)揮重要作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，氯喹作用肝癌細(xì)胞后，磷酸化的P53蛋白表達(dá)增加，活化型Caspase-3的表達(dá)量顯著上升，Bax的表達(dá)量增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量卻降低。這說明，P38MAPK可通過活化P53后調(diào)控Bax、Bcl-2和Caspase-3等誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，氯喹可能是通過激活P38MAPK來活化下游凋亡信號通路，促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡。然而氯喹是直接作用于P38MAPK信號分子還是通過調(diào)節(jié)其上游信號分子發(fā)揮作用仍不清楚，尚需進(jìn)行更深入的研究和探索。