毛 祥， 夏 玙， 張蕓曌， 朱 敏， 張 曼， 黃 丹， 羅惠波，*

(1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院， 四川 自貢 643000；2.四川省川南曬制麩醋生物釀造技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室， 四川 自貢 643000)

四川麩醋是中國(guó)四大名醋之一，具有色澤紅棕、醇香回甜、酸味柔和、久陳不腐的特點(diǎn)[1-2]。以麩皮為制醋原料，通過(guò)糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等工藝自然開發(fā)式生產(chǎn)，屬于傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵[3]。

關(guān)于四川麩醋的研究多關(guān)注于發(fā)酵過(guò)程微生物、風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化及某一功能菌的篩選[4]。如劉軍等[1]分析了保寧醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)含量的變化，彭?xiàng)畹萚2]對(duì)其固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中真菌和細(xì)菌的多樣性進(jìn)行分析；于華等[5]從醋醅中篩選出一株產(chǎn)酸能力強(qiáng)的芽孢桿菌，并對(duì)其產(chǎn)酸特性進(jìn)行研究。目前針對(duì)四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群、品質(zhì)形成機(jī)理與調(diào)控、風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成及保持等研究較少。

曲藥是麩醋釀造的發(fā)酵啟動(dòng)劑，能提供豐富的菌系和酶系，為液化、糖化、酒化、發(fā)酵生香提供動(dòng)力[6]。曲藥微生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期馴化，其種類不斷豐富，其中產(chǎn)酯酵母也存在于曲藥中，對(duì)醋的風(fēng)味形成起到重要作用[7]，但有關(guān)曲藥中微生物的研究鮮有報(bào)道。本研究從四川某麩醋廠提供的曲藥中分離篩選出一株產(chǎn)酯酵母菌，并對(duì)其生長(zhǎng)特性和發(fā)酵代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，旨在為提高麩醋的質(zhì)量和增加其風(fēng)味提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

麩醋曲藥，四川某麩醋廠；大米、麩皮，市售；牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、瓊脂麥芽糖、可溶性淀粉、糖化酶、中性蛋白酶、乳糖、葡萄糖，均為生化試劑，成都市科龍化工試劑廠；氯化鈉、尿素、KH2PO4、氫氧化鈉、脫氧膽酸鈉、氯仿，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；三丁酸甘油酯，色譜純，四川都康生物科技有限公司。YPD培養(yǎng)基、產(chǎn)酯平板篩選培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基加0.4%三丁酸甘油酯、虎紅瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、無(wú)碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基[8]、無(wú)氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基[8]；50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BH200型生物顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；STARTER2C型pH計(jì)，福建省泉州市高科杰實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；250HL型恒溫培養(yǎng)箱，金壇市岸頭中旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；YX- 24LDJ型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；TD- 5Z型臺(tái)式低速多管架離心機(jī)，北京億達(dá)科創(chuàng)科技有限公司；可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器廠；S1000TM型PCR儀，北京博雅創(chuàng)新科技發(fā)展有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；HT300A型自動(dòng)固相微萃取儀，意大利HTA公司； 7890A- 5975B型氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1發(fā)酵基的配制

大米糖化液的制備：稱取500 g大米粉末于適當(dāng)?shù)娜萜髦屑尤? 500 mL水，蒸煮20 min后放涼至50 ℃并調(diào)節(jié)pH值為4.8～5.4；加入淀粉酶(每克干物質(zhì)96個(gè)酶活力單位)，50 ℃水浴液化30 min，液化完成后調(diào)節(jié)pH值為4.0～4.5；加入糖化酶216 U/(g干物質(zhì))，60 ℃，糖化35 h后煮沸滅酶，冷卻至室溫后4 000 r/min，離心3 min，收集上清液備用[9-10]。

麩皮浸提液制備：稱取100 g麩皮于適當(dāng)容器中加入500 mL水，蒸煮10 min后放涼至50 ℃并調(diào)節(jié)pH值為4.8～5.4，加入淀粉酶1 500 U/(g干物質(zhì))，50 ℃水浴10 min，完成后調(diào)節(jié)pH值至中性；加入中性蛋白酶50 000 U/(g干物質(zhì))，55 ℃水浴30 min，過(guò)濾后取濾液煮沸滅酶，冷卻至室溫后4 000r/min，離心3 min，收集上清液備用[11]。按照大米糖化液與麩皮浸提液之比為7∶3(體積比)，制備發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.2曲藥中酵母菌的分離純化

將曲藥用研缽研磨后稱取10 g至100 mL無(wú)菌生理鹽水，150 r/min、28 ℃下振蕩30 min；取1 mL原液，依次進(jìn)行10倍稀釋，稀釋至10-7倍；對(duì)10-5、10-6、10-7稀釋倍數(shù)菌懸液進(jìn)行平板涂布，涂布于YPD培養(yǎng)基和虎紅瓊脂培養(yǎng)基(在倒平板前應(yīng)按照每100 mL培養(yǎng)基加入2%的脫氧膽酸鈉溶液2 mL以抑制霉菌菌絲蔓延)，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h；挑取單菌落，在YPD平板上劃線純化，純菌株移入斜面保藏備用。

1.3.3酵母菌的初步鑒定

觀察并記錄篩選的酵母菌菌落大小、形狀、顏色、透明度、邊緣、質(zhì)地、濕潤(rùn)程度等菌落特征；取生理鹽水1滴，滴于載玻片中央，用接種環(huán)挑取菌落少許，涂勻，加蓋玻片，于40倍顯微鏡鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；觀察記錄菌體形狀、大小、出芽情況、芽體形態(tài)、是否有裂殖現(xiàn)象等。

1.3.4酵母菌的18S rDNA分子鑒定

提取酵母菌總DNA[12]，進(jìn)行18S rDNA的PCR擴(kuò)增，通用引物NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL- 4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3′)。PCR反應(yīng)體系(50 uL)為：無(wú)菌超純水33.5 μL，Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Mg2+3 μL，兩個(gè)引物各1 μL(10 mol/L)，模板2 μL，Taq聚合酶0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min；通過(guò)140 V電泳20 min檢測(cè)結(jié)果。將測(cè)得的序列在GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，并將獲得的同源序列和測(cè)定序列在Clustalx軟件包中進(jìn)行分析，形成一個(gè)多重序列匹配排列陣。通過(guò)MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5酵母菌生長(zhǎng)特性實(shí)驗(yàn)

探究不同濃度的pH值、碳源、氮源、酒精度的發(fā)酵條件對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響。將發(fā)酵培養(yǎng)基pH值分別調(diào)節(jié)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，以5%接種量接入目的菌株，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定不同pH值下的發(fā)酵液OD600值；以淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖為碳源，分別加入無(wú)碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以5%接種量接入目的菌株，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定不同碳源的發(fā)酵液OD600值；以尿素、酵母膏、蛋白胨、硫酸銨作為氮源，分別加入無(wú)氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以5%接種量接入目的菌株，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定不同氮源的發(fā)酵液OD600值。在滅菌后的YPD液體培養(yǎng)基中，將酒精濃度分別調(diào)節(jié)為0%、2%、4%、6%、8%、10%，以5%接種量接入目的菌株，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定不同酒精濃度的發(fā)酵液OD600值。

圖1 初篩平板產(chǎn)酯透明圈圖Fig.1 Transparent zone of ester production of initial screening plate

1.3.6發(fā)酵代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性成分的定量測(cè)定

樣品前處理：吸取6 mL空白液和發(fā)酵液放入15 mL的頂空瓶中，加入1.5 g氯化鈉，20 μL標(biāo)品；在60 ℃萃取40 min，并230 ℃解吸3 min。GC-MS條件參數(shù)：色譜條件為DB-FFAP彈性石英毛細(xì)管柱，柱長(zhǎng)30 mm，內(nèi)徑0.25 mm，液膜厚度0.25 μm，載氣為氦氣，流量1.0 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度230 ℃；柱溫為起始溫度35 ℃，以5 ℃/min 的速度升至180 ℃，再以10 ℃/min 的速度升至230 ℃，保持5 min。質(zhì)譜條件為電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電離方式EI，質(zhì)量掃描范圍20～500 amu，溶劑延遲3 min。數(shù)據(jù)分析：檢出揮發(fā)性物質(zhì)的質(zhì)譜圖，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)(NIST05a.L)對(duì)比鑒定，匹配度和純度大于800作為鑒定結(jié)果[13]。以乙酸丁酯為內(nèi)標(biāo)，按峰面積歸一化法算出樣品中各組分的相對(duì)含量[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌的分離純化及篩選結(jié)果

通過(guò)稀釋涂布和平板劃線，從曲藥中分離出10株酵母菌，分別編號(hào)Y1至Y10。Y1、Y2、Y3、Y8、Y10為第一類：菌落為乳白色、較濕潤(rùn)、邊緣整齊、表面干燥、隆起圓整；Y4、Y5、Y7、Y9為第一類：菌落為白色、濕潤(rùn)、邊緣整齊，表面光滑，隆起圓整；第三類是Y6，菌落為乳白色、濕潤(rùn)、邊緣整齊、表面光滑、隆起圓整。形態(tài)特征的分類：第一類呈橢圓狀，第二類呈橢圓狀，第三類呈圓形；三類酵母菌均為芽殖。

將Y1至Y10酵母菌株點(diǎn)種到產(chǎn)酯平板篩選培養(yǎng)基上得到圖1，測(cè)量并計(jì)算透明圈直徑D和菌落直徑d之比得到表1。從表1中可看出菌株Y1的D/d最大，故選擇Y1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)菌株。

表1 酵母菌株Y1-Y10產(chǎn)酯透明圈結(jié)果

2.2 目的菌株的18S rDNA分子鑒定結(jié)果

對(duì)酵母菌株Y1提取總DNA，并進(jìn)行18S rDNA的PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖2。由圖2可以看出，PCR電泳圖條帶單一，清晰且明亮，無(wú)拖尾、無(wú)彌散現(xiàn)象、無(wú)二聚體條帶；擴(kuò)增出來(lái)的18S rDNA條帶大小為750～1 000 bp，與目標(biāo)長(zhǎng)度一致，可以將PCR產(chǎn)物被送至測(cè)序公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，獲得同源性高的序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，如圖3。鑒定酵母菌Y1為異常威克漢姆酵母菌亞種，命名為Wicherhamomycessp.Lzcq 2014。

圖2 酵母Y1 18S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Amplified electrophoretic profile of 18S rDNA regions of yeast Y1

圖3 酵母菌Y1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeast Y1

2.3 分離菌株的生長(zhǎng)特性分析

圖4 不同pH、酒精濃度、碳源、氮源對(duì)Wicherhamomyces sp. Lzcq 2014生長(zhǎng)量的影響Fig.4 Effects of different pH values, alcohol concentrations, carbon sources, and nitrogen sources on mass growth of Lzcq 2014

不同初始pH值、酒精濃度、碳源、氮源下培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵液酵母生長(zhǎng)情況如圖4。通常，微生物在pH值為3.0～9.0的環(huán)境中正常生長(zhǎng)，超出這個(gè)范圍則容易死亡。當(dāng)微生物處于強(qiáng)酸環(huán)境中，因細(xì)胞膜的質(zhì)子“泵”失去平衡而不能調(diào)節(jié)體內(nèi)外的質(zhì)子濃度差，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酵母菌Wicherhamomycessp.Lzcq 2014菌株的最適生長(zhǎng)pH值為5.0～5.5，其適合在偏弱酸性的環(huán)境生長(zhǎng)。目前，酵母的酒精耐受機(jī)理還未完全清楚，溫度和滲透壓等因素均與酵母的酒精耐性有關(guān)[15]。Wicherhamomycessp.Lzcq 2014菌株在發(fā)酵代謝的時(shí)候，會(huì)產(chǎn)生酒精。產(chǎn)酯酵母對(duì)乙醇的親和力較好，當(dāng)有一定濃度乙醇存在時(shí)，更有利于酯類物質(zhì)的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Wicherhamomycessp. Lzcq 2014菌株的生長(zhǎng)量隨著酒精度的增大而變小，呈一定的反相關(guān)關(guān)系，且在酒精度為10%時(shí)，生長(zhǎng)量幾乎為零，說(shuō)明該酵母不適宜在有一定酒精濃度的環(huán)境中生長(zhǎng)。酵母的生長(zhǎng)繁殖需要一定的碳源和氮源，不同碳源、氮源的分子結(jié)構(gòu)不一樣，微生物對(duì)其利用生長(zhǎng)狀況也會(huì)不一樣。劉曉明等[16]研究了酵母對(duì)不同碳源(玉米粉、麩皮、豆面、葡萄糖)的利用效果，結(jié)果表明玉米粉對(duì)酵母發(fā)酵為較佳碳源。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Wicherhamomycessp. Lzcq 2014對(duì)不同單一碳源的同化能力的強(qiáng)弱。順序依次是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉，Wicherhamomycessp. Lzcq 2014對(duì)不同氮源的同化能力的強(qiáng)弱順序依次是酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、尿素。

2.4 分離菌株發(fā)酵代謝的揮發(fā)性成分分析

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)，對(duì)空白培養(yǎng)基和Wicherhamomycessp. Lzcq 2014發(fā)酵液的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2、表3。由表2、表3可以看出，發(fā)酵液中主要的成分是乙酸乙酯、甲酸異戊酯、丙酸苯乙酯和苯乙醇等，且乙酸乙酯濃度遠(yuǎn)高于其他化合物，其質(zhì)量濃度為0.641 mg/L，說(shuō)明這是一株高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌株；其他化合物的含量相對(duì)較少。丙酸苯乙酯的含量變化可能是由于酵母菌在生長(zhǎng)過(guò)程中分解了部分丙酸苯乙酯。2,4-二叔丁基苯酚和環(huán)己醇在發(fā)酵液中未檢出，說(shuō)明已被分解或轉(zhuǎn)化成其他化合物。只在發(fā)酵液中檢出甲酸異戊酯，說(shuō)明此化合物是新生成的。

表2 空白培養(yǎng)基揮發(fā)性成分

表3 酵母Y1發(fā)酵代謝揮發(fā)性成分

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從麩醋曲藥中分離出10株酵母菌，分別編號(hào)為Y1至Y10，通過(guò)產(chǎn)酯平板篩選培養(yǎng)基得出Y1為這10株菌中產(chǎn)酯最好的一株，因此將Y1作為實(shí)驗(yàn)菌株。通過(guò)18S rDNA分子鑒定和構(gòu)建酵母菌Y1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹確定酵母菌Y1為異常威克漢姆酵母菌亞種(命名為Wicherhamomycessp.Lzcq 2014)。Wicherhamomycessp. Lzcq2014的最適合生長(zhǎng)pH值在5.0～5.5，其耐酒精的能力相對(duì)較弱，在酒精度為10%的情況下幾乎不再生長(zhǎng)；對(duì)不同碳源的同化能力的強(qiáng)弱順序依次是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉；對(duì)不同氮源的同化能力的強(qiáng)弱順序依次是酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、尿素。通過(guò)HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析發(fā)酵液的揮發(fā)性風(fēng)味成分，得出發(fā)酵液中主要成分是乙酸乙酯，其質(zhì)量濃度為0.640 79 mg/L，遠(yuǎn)高于其他代謝產(chǎn)物。其他代謝產(chǎn)物分別為甲酸異戊酯、丙酸苯乙酯、苯乙醇，質(zhì)量濃度分別為0.041 36、0.039 43、0.023 00 mg/L。