狄明玉，周遵春，李云峰，田梅琳，侯紅漫，李玉龍，鮑相渤，赫崇波

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034； 2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023 )

海蜇(Rhopilemaesculenta)廣泛分布在中國的東海、黃海、渤海海域，是經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的可食用水母，具有較高的膳食、醫(yī)藥價(jià)值[1-3]。中國作為最早開發(fā)利用海蜇的國家，在1700年前就對其進(jìn)行商業(yè)開發(fā)。海蜇生長周期短，生長速度快，能夠在較短的時間內(nèi)帶來較大的經(jīng)濟(jì)效益，亞洲國家海蜇相關(guān)產(chǎn)業(yè)每年有數(shù)百萬美元的收益[4]。近幾年來，海蜇市場需求持續(xù)增大，漁民的過度捕撈、生態(tài)環(huán)境的破壞及災(zāi)害水母的頻發(fā)等，導(dǎo)致海蜇自然種群結(jié)構(gòu)被破壞，種質(zhì)退化嚴(yán)重，資源量大幅度下降[5-6]。因此，需要加強(qiáng)對海蜇自然群體種質(zhì)資源保護(hù)的重視，將海蜇種質(zhì)資源保護(hù)的相關(guān)研究列為重要研究方向。

分子標(biāo)記是進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究的重要工具[7]。其中，微衛(wèi)星分子標(biāo)記具有分布范圍廣、呈共顯性遺傳、多態(tài)性高和重復(fù)性好等特點(diǎn)[8-9]，在群體遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評價(jià)、遺傳圖譜的構(gòu)建等方面的研究中具有明顯的優(yōu)勢[10-11]。本試驗(yàn)利用篩選出的30對多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)，對位點(diǎn)采用熒光標(biāo)記，應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)精準(zhǔn)檢測，對海蜇4個不同地理種群的種質(zhì)資源現(xiàn)狀和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，旨在為海蜇優(yōu)良種質(zhì)資源保護(hù)和分子遺傳育種提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗(yàn)所用的4個海蜇自然群體于2015年7—9月分別采自天津大港[體質(zhì)量(4.23±0.64) kg]、遼寧盤錦[體質(zhì)量(3.91±0.65) kg]、江蘇射陽[體質(zhì)量(3.89±0.58) kg]和山東煙臺[體質(zhì)量(4.09±0.54) kg]附近的海域，每個群體隨機(jī)采集30只活體成蜇，取其傘部組織以及口腕部組織置于95%的酒精中固定，-20 ℃冰箱冷凍保存，用于后續(xù)的基因組DNA提取。

1.2 DNA提取

各群體的海蜇個體各稱取30 mg組織，采用CTAB法[12]提取基因組DNA，DNA樣品用含量為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用ThermoNanoDrop 2000 分光光度計(jì)檢測DNA的質(zhì)量濃度與純度，將DNA質(zhì)量濃度稀釋到100 ng/μL用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。

1.3 微衛(wèi)星引物的篩選和PCR擴(kuò)增

本試驗(yàn)所用的微衛(wèi)星引物序列獲得是基于實(shí)驗(yàn)室前期工作[13]，由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。用120對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中包括： 2×Multiplex PCR Master Mix(天根，北京，中國)5 μL，上、下游引物各0.5 μL，15～30 ng的模板DNA，其余體積用超純水補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃變性5 min；95 ℃熱變性30 s，引物各自退火溫度下復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。以10個個體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，先用1%的瓊脂糖凝膠電泳初篩，篩選出有目的條帶的引物，之后用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳復(fù)篩，篩選出多態(tài)性豐富的位點(diǎn)。詳細(xì)引物信息見表1。

表1 30對海蜇微衛(wèi)星位點(diǎn)信息

續(xù)表1

1.4 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳分析

根據(jù)已篩選出的多態(tài)性位點(diǎn)，合成熒光引物。在每對引物上游5′端添加不同的熒光基團(tuán)(FAM、HEX、ROX)，下游為常規(guī)堿基序列。將合成的熒光引物溶解，稀釋至濃度為2 μmol/L。對4個海蜇群體的120個樣品逐一進(jìn)行每對引物的PCR擴(kuò)增，之后向ABI3739XL上樣進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，通過軟件Genemapper輸出擴(kuò)增產(chǎn)物長度圖。

1.5 種群遺傳性統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)各微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)的基因片段長度進(jìn)行基因分型，利用Popgen 3.2計(jì)算4個海蜇群體在30個微衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、遺傳分化指數(shù)、基因流、群體間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù),采用軟件Genepop對4個海蜇群體在各個位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，利用軟件PIC_Calc 0.6計(jì)算多態(tài)信息含量，基于Popgen 3.2 計(jì)算的各個群體間的遺傳距離，采用軟件Mega 6.0繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多樣性

從4個海蜇群體整體來看，30個微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測到304個等位基因，每個位點(diǎn)的等位基因個數(shù)為4～17個，所有位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)為10.133，其中位點(diǎn)HZ0009和HZ0067的等位基因均為17個，等位基因數(shù)量最多；位點(diǎn)HZ0122的等位基因?yàn)?個，數(shù)量最少。觀測雜合度為0.0252～0.7667，平均值為0.4103；期望雜合度為0.0251～0.8163，平均值為0.5205。30個多態(tài)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量為0.0248～0.7888，平均值為0.4909。通過以上數(shù)據(jù)可知，這些位點(diǎn)可以有效的進(jìn)行群體間遺傳多樣性的分析(表2)。

2.2 4個海蜇群體的遺傳多樣性分析

由4個海蜇群體的遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)信息可知，4個群體的平均等位基因數(shù)差距較小，依次為煙臺群體(6.8333)、大港群體(6.20)、盤錦群體(4.6333)、射陽群體(4.0333)；大港群體的觀測雜合度(0.5059)、期望雜合度(0.5986)和多態(tài)信息含量(0.5497)均為最高；而盤錦群體的期望雜合度(0.4353)和多態(tài)信息含量(0.3902)均為最低；觀測雜合度以煙臺群體(0.3906)最低。綜合這些參數(shù)得知，大港群體的遺傳多樣性最高(表3)。

表2 海蜇30個微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性指數(shù)

在120個位點(diǎn)組合(4個群體×30個引物)中，HZ0032和HZ0043在盤錦群體中為單態(tài)位點(diǎn)，HZ0122在射陽群體顯示為單態(tài)位點(diǎn)。對其他的位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測，發(fā)現(xiàn)有83個(70.9%)位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，有34個(29.1%)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。

表3 30個微衛(wèi)星位點(diǎn)在4個海蜇群體中遺傳多樣性信息

注：*，顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，P<0.05；**，極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，P<0.01.

2.3 群體間遺傳結(jié)構(gòu)分析

4個海蜇群體間的遺傳分化指數(shù)與基因流見表4。群體間的遺傳分化指數(shù)為0.043～0.068，其中大港群體與射陽群體遺傳分化指數(shù)最高，為0.068，其次為煙臺群體與射陽群體，為0.067，之后為盤錦群體與射陽群體，為0.063，煙臺群體與盤錦群體的遺傳分化指數(shù)最低， 為0.037。群體間的基因流為3.446～6.556，其中盤錦群體與煙臺群體的基因流最大，為6.556；其次為大港群體與煙臺群體，基因流值為5.528；大港群體與射陽群體間的基因流值最小，為3.446。

由4個群體間的Nei′s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離得知，盤錦群體與射陽群體間的遺傳距離最遠(yuǎn)(0.1629)，盤錦群體與煙臺群體間的遺傳距離最近(0.0653)(表5)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，盤錦群體與煙臺群體首先聚成一支，之后與大港群體聚為一支，最后再與射陽群體聚為一類(圖1)。

表4 海蜇群體間基因流(對角線以下)和遺傳分化指數(shù)(對角線以上)

表5 海蜇群體間遺傳相似系數(shù)(對角線以上)和遺傳距離(對角線以下)

圖1 基于Nei′s無偏遺傳距離構(gòu)建的4個海蜇群體的系統(tǒng)進(jìn)化樹分支上的數(shù)字代表分支長度.

3 討 論

3.1 群體遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是群體維持長期生存和發(fā)展進(jìn)化的前提，也是衡量群體抵御不良環(huán)境能力強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)[14]。等位基因數(shù)和群體雜合度是對群體遺傳多樣性水平進(jìn)行評估的重要參數(shù)。有研究指出，對于微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇，等位基因數(shù)>4時，可以較好的反映出群體遺傳多樣性水平[15]，本研究中，4個群體的平均等位基因?yàn)?.0333～6.8333，該數(shù)據(jù)能夠有效的用于4個群體遺傳多樣性分析。4個群體的平均觀測雜合度為0.3906～0.5059，平均期望雜合度為0.4353～0.5986，表明4個群體的遺傳多樣性較為豐富。與前期自然海蜇群體、養(yǎng)殖海蜇群體的遺傳多樣性研究結(jié)果相比，本試驗(yàn)4個群體的平均等位基因數(shù)均高于前期研究的自然群體(3.120)和養(yǎng)殖群體(2.360)；平均觀測雜合度也高于自然群體(0.302)和養(yǎng)殖群體(0.180)[13]。造成這一現(xiàn)象的原因可能為，本試驗(yàn)采用的熒光標(biāo)記毛細(xì)管比前期使用的聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率高，減少了等位基因少讀的情況；此外，兩個試驗(yàn)所用群體樣本不同也可能導(dǎo)致這種現(xiàn)象產(chǎn)生。其中，大港群體的平均觀測雜合度(0.5059)和平均期望雜合度(0.5986)均高于其他3個群體，說明大港群體具有較高的變異度，遺傳多樣性較其他3個群體豐富，抵御不良環(huán)境的能力較強(qiáng)，可以用于海蜇分子遺傳育種中，可能對種質(zhì)改良有很大幫助。

多態(tài)信息含量是衡量基因位點(diǎn)群體多態(tài)性的重要指標(biāo)之一，可以反映出群體的遺傳變異程度[16]。當(dāng)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量>0.5時，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)0.25<多態(tài)信息含量<0.5時，該位點(diǎn)為中度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)多態(tài)信息含量<0.25時，該位點(diǎn)為低度多態(tài)位點(diǎn)[17]。本研究30個微衛(wèi)星位點(diǎn)中，有15個位點(diǎn)表現(xiàn)為高度多態(tài)位點(diǎn)，11個位點(diǎn)表現(xiàn)為中度多態(tài)位點(diǎn)，4個位點(diǎn)表現(xiàn)為低度多態(tài)位點(diǎn)。總體來說位點(diǎn)多態(tài)性較高，并且位點(diǎn)個數(shù)大于25，在群體遺傳多樣性分析中，得出的結(jié)果可靠性較高[18]。對4個群體的多態(tài)信息含量計(jì)算結(jié)果表明，群體的平均多態(tài)信息含量為0.3902～0.5497，除大港群體表現(xiàn)為高度多態(tài)性外，其他3個群體均表現(xiàn)為中度多態(tài)性。

在4個地理群體中均觀測到部分位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡，其中大港群體有12個位點(diǎn)，盤錦群體有10個位點(diǎn)，射陽群體和煙臺群體均有6個位點(diǎn)。在盧彥先等[13]的自然海蜇群體和養(yǎng)殖海蜇群體的遺傳多樣性研究中，也存在這種偏離平衡的現(xiàn)象，在兩個群體中均有超過50%的微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡。偏離平衡的原因可能是，海蜇特殊的生長和繁殖方式易造成近親繁殖，導(dǎo)致群體中雜合子缺失；也可能是無效等位基因的存在引起的。相關(guān)的研究表明，微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡的現(xiàn)象普遍存在于海洋生物中，如魚類、蝦類、貝類等[19-20]。

3.2 群體間遺傳分化及遺傳距離分析

本研究用遺傳分化指數(shù)來判斷群體間的遺傳分化程度，再結(jié)合群體間的基因流來分析4個群體間遺傳分化的內(nèi)在機(jī)制。根據(jù)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，0<遺傳分化指數(shù)<0.05時,表現(xiàn)為低等分化水平；0.05<遺傳分化指數(shù)<0.15時，表現(xiàn)為中等分化水平；遺傳分化指數(shù)>0.15時，表現(xiàn)為高等分化水平[21]?；蛄?1，表明分化程度較大；1<基因流<4，表明分化程度中等；基因流>4，表明分化程度較低[22]。本研究的4個群體間遺傳分化指數(shù)為0.037～0.068,群體間遺傳分化指數(shù)的均值為0.056，分化水平處于中等以下。除了煙臺和盤錦、煙臺和大港群體間的遺傳分化處于低等分化水平外，其余兩兩群體間的遺傳分化均處于中等分化水平。群體之間遺傳分化的存在，對于物種資源的恢復(fù)具有重要意義[23]。本研究中，海蜇各個群體之間均存在著不同水平的遺傳分化，增加了海蜇自然資源恢復(fù)的可能性。4個群體間的基因流為3.446～6.556，均值為4.458。研究發(fā)現(xiàn)，一定程度的基因流可以抵制由遺傳漂變引起的種群遺傳資源的衰退[24]。本研究中，大港與射陽群體間的遺傳分化指數(shù)最大，基因流最小；在煙臺和盤錦兩群體間的遺傳分化指數(shù)最小，基因流最大。

4個群體的Nei′s無偏遺傳距離聚類分析結(jié)果表明，地理位置較近的盤錦和煙臺群體首先聚為一支，再與相對較近同為渤海區(qū)域的大港群體聚為一支，最后才與相對較遠(yuǎn)的射陽群體聚為一類，這與實(shí)際的地理分布差距成正相關(guān)，即隨著距離的變大，遺傳距離也隨之增大，遺傳相似度減小。由此可見，地理距離對海蜇自然群體的遺傳分化程度有較大的影響，煙臺、盤錦群體相差距離較小，相互之間的基因交流較多，遺傳分化程度較低。此結(jié)論與群體間遺傳分化程度的分析結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，4個不同地理位置的自然海蜇群體的遺傳多樣性處于中等偏上水平，同時，各個群體均存在著Hardy-Weinberg平衡的偏離和雜合子缺失現(xiàn)象。為緩解Hardy-Weinberg平衡偏離和雜合子缺失現(xiàn)象，在進(jìn)行增殖放流時，應(yīng)對其遺傳結(jié)構(gòu)多做了解，盡可能地減少人為因素對海蜇自然種質(zhì)資源的影響。在海蜇的增養(yǎng)殖工作中，選擇遺傳潛力大、遺傳距離較遠(yuǎn)的群體作為人工繁殖的親本，通過優(yōu)質(zhì)群體間的交配提高養(yǎng)殖海蜇的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)海蜇增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)綠色、健康、可持續(xù)發(fā)展。