鄧正華, 陳明強(qiáng), 王 雨, 黃桂菊, 于 剛，吳開暢, 李有寧

( 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300 )

合浦珠母貝(Pinctadafucata)又稱馬氏珠母貝(P.martensii)，是培育海水珍珠的主要暖水性海洋雙殼貝類，主要分布于中國、日本、印度、澳大利亞和東南亞等熱帶和亞熱帶的沿海國家，在中國分布于廣東、廣西和海南等沿海[1-2]。聞名遐邇的“南珠”就是以合浦珠母貝培育的珍珠，該珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)為部分沿海地區(qū)支柱產(chǎn)業(yè)之一[3]，已形成一條完整的產(chǎn)業(yè)鏈。國內(nèi)外對合浦珠母貝的研究主要集中在遺傳育種[4]、苗種繁育[5]、攝食生理[6]、免疫學(xué)[7]及分子生物學(xué)[8-11]等方面。雖自1965年就已成功開展了合浦珠母貝的人工繁育研究[4]，但幼蟲培育的死亡率較高，苗種培育效果極不穩(wěn)定。目前，合浦珠母貝的苗種供應(yīng)仍依賴親貝的大繁殖量，提高人工育苗的幼蟲成活率勢在必行。在其他海洋雙殼貝類幼蟲培育中，通過分析單胞藻營養(yǎng)價值和幼蟲營養(yǎng)需求[12-16]，調(diào)控單胞藻投喂量和投喂頻率[17-18]，以及尋找其他替代餌料[19]可提高幼蟲生長速率和成活率。但是，并非所有的單胞藻都能被幼蟲攝食和消化[20-21]，充分了解投喂餌料的消化、吸收率是餌料選擇的基礎(chǔ)。單胞藻胞徑、消化難易及生化組成等直接影響其能否作為幼蟲培育的餌料，尤其是消化性直接影響幼蟲的生長和成活率。Martínez-Fernández等[20]用10種單胞藻投喂企鵝珍珠貝(Pteriasterna)幼蟲，僅有5種能被攝食，2種能被消化；Lora-Vilchis等[22]分別用10種單胞藻投喂卡塔琳娜扇貝(Argopectenventricosus)幼蟲，僅有7種能被攝食，3種能被消化；鄧正華等[21]用9種單胞藻投喂黃邊糙鳥蛤(Trachycardiumflavum)幼蟲，其更易攝食胞徑較小的球形單胞藻，細(xì)胞裸露無細(xì)胞壁的單胞藻更易被消化。筆者用光學(xué)顯微鏡觀察了不同日齡合浦珠母貝幼蟲對苗種培育中常用的10種單胞藻的攝食與消化情況，給幼蟲單獨與混合投喂易攝食、易消化不同密度的單胞藻，比較幼蟲的生長與成活狀況，為幼蟲培育選擇合適的單胞藻餌料及投喂策略。

1 材料與方法

1.1 材料

2齡合浦珠母貝親貝殼長約6 cm，取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心陵水試驗基地。挑選性腺飽滿的個體，清除表面附著物，刷洗干凈，置于陰涼處陰干刺激3 h，移入育苗水泥池中流水刺激，使其自然產(chǎn)卵、受精。24 h后受精卵發(fā)育至D形幼蟲，用400目篩絹網(wǎng)濾出、清洗，再移至育苗水泥池中培養(yǎng)，密度為5 個/mL。幼蟲培育期間日換水30%～50%，8:00和18:00混合投喂湛江叉鞭金藻(Dicrateriazhanjiangensis)與綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)，投喂量為1×103～5×103個/mL。幼蟲培育期間水溫(27.03±1.22) ℃、pH 8.20±0.03、鹽度28.45±1.20。

以上兩種藻類在頂部直徑90 cm、底部直徑80 cm、高74 cm的玻璃缸纖維桶內(nèi)，添加F/2營養(yǎng)液[23]，自然光照(0～5000 lx)下一次性培養(yǎng)。用于幼蟲攝食和消化試驗的10種單胞藻(表1)，在5 L錐形瓶中添加F/2營養(yǎng)液，于5000 lx(0 D∶24 L)光照下密封培養(yǎng)，每日搖晃錐形瓶2次，每5～7 d重新接種單胞藻。試喂時，10種單胞藻均處于快速生長期。

表1 用于飼喂幼蟲的10種單胞藻胞徑及主要特征

1.2 方法

1.2.1 幼蟲對單胞藻的攝食與消化

受精后第2、8、14、18、22 d，自育苗池中取一部分幼蟲，用孔徑為47 μm的篩絹網(wǎng)過濾清洗后轉(zhuǎn)移至過濾海水中饑餓12 h，然后放入分別裝有400 mL密度為105個/mL 10種單胞藻液的10個500 mL燒杯中，幼蟲密度為5個/mL。幼蟲在含有單胞藻水體中攝食1 h后取出，在phenix-ph 50顯微鏡下觀察幼蟲對單胞藻的攝食情況。已攝食的幼蟲，用孔徑為47 μm的篩絹網(wǎng)過濾清洗后轉(zhuǎn)移至過濾海水中。在幼蟲攝食后的第1、2、4 h，每次、每組至少觀察20個幼蟲胃內(nèi)單胞藻的消化情況。

1.2.2 幼蟲攝食不同單胞藻的成活率

在5 個/mL幼蟲的水泥池中，給幼蟲投喂3組餌料：湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻及兩種單胞藻數(shù)量比為1∶1的混合藻，每組餌料均設(shè)置3個平行。每日6:00、12:00、18:00和24:00投喂，投喂量為1×103～5×103個/mL，日換水30%～50%。每隔幾日自培育池中取一部分幼蟲，測量殼長(n=30)，受精后第22 d，用體積為1 L的采水器以9點法(培育池的8個頂角和中心)采集9 L水樣，混合，自混合水樣中取一定體積水樣(幼蟲個數(shù)大于500個)，滴入2滴NaClO2使幼蟲沉淀，收集沉淀幼蟲集中至1 mL浮游生物計數(shù)框中，用顯微鏡檢測計數(shù)，統(tǒng)計幼蟲成活率。

1.2.3 單胞藻投喂量對幼蟲成活率的影響

在20 L培育桶中，以5個/mL的密度培養(yǎng)幼蟲，每日8:00和18:00分別向培育桶內(nèi)幼蟲投喂2×103、20×103個/mL和40×103個/mL的湛江叉鞭金藻，每種密度均設(shè)置3個平行，培育桶日換水1次。幼蟲培育至受精后第6 d，用篩絹網(wǎng)采集幼蟲，在顯微鏡下測量幼蟲殼長(n=30)，計數(shù)并統(tǒng)計幼蟲成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 21統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，用LSD法多重比較各組間數(shù)值的差異顯著性(P<0.05)；用Toup View圖像分析軟件對顯微鏡下放大后的幼蟲進(jìn)行拍照和測量大?。挥肞hotoshop CS5對圖像進(jìn)行處理；用Origin 9.1做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼蟲對10種單胞藻的攝食與消化

幼蟲對10種單胞藻的攝食、消化和空胃狀態(tài)見圖1。幼蟲剛攝入單胞藻時，胃內(nèi)可見完整的單胞藻；當(dāng)單胞藻消化時，胃內(nèi)單胞藻呈彌散狀；單胞藻完全消化排泄時，胃空；消化盲囊吸收單胞藻營養(yǎng)物質(zhì)，其顏色與單胞藻相同。

不同日齡幼蟲對10種單胞藻的攝食與消化結(jié)果見表2。由表2可見，各日齡幼蟲均能攝食小球藻、微綠球藻、湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻和球等鞭金藻；對亞心形扁藻、三角褐指藻和小新月菱形藻均不攝食，隨著幼蟲的生長，僅見部分或極少數(shù)幼蟲攝食少量的杜氏鹽藻和牟氏角毛藻。小球藻和微綠球藻很難被消化，在幼蟲胃內(nèi)未經(jīng)完全消化就以完整細(xì)胞排出，湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻和球等鞭金藻則較易消化。隨著生長，幼蟲可攝食更大胞徑的單胞藻，消化排泄能力也逐漸增強(qiáng)。

圖1 合浦珠母貝幼蟲對單胞藻的攝食、消化與空胃Ⅰ.胃中單胞藻細(xì)胞全部完整；Ⅱ.胃中單胞藻部分或全部裂解；Ⅲ.幼蟲對單胞藻剛好完全消化排泄.

注：Ⅰ.胃中單胞藻完整； Ⅱ.胃中單胞藻部分或全部裂解； Ⅲ.單胞藻剛好被完全消化排泄； NO.未攝食； PAR.部分幼蟲攝食； FEW.極少數(shù)幼蟲攝食.

2.2 不同種類及密度單胞藻對幼蟲生長與成活的影響

培育至受精后22 d時，攝食混合餌料的幼蟲殼長與成活率分別為(195.91±19.00) μm、(11.33±0.98)%，攝食綠色巴夫藻的幼蟲殼長與成活率分別為(179.23±16.60) μm、(10.32±0.99)%，攝食湛江叉鞭金藻的幼蟲殼長與成活率分別為(172.14±13.32) μm、(7.34±0.98)%(圖2)，表明混合餌料組幼蟲的殼長和成活率均顯著高于兩種單胞藻單獨投喂(P<0.05)，攝食綠色巴夫藻組幼蟲殼長和成活率又顯著高于攝食湛江叉鞭金藻的幼蟲(P<0.05)。

幼蟲培育中，湛江叉鞭金藻投喂量分別為2×103、20×103個/mL和40×103個/mL，培育至受精后第6 d時，隨投喂單胞藻密度的增加，幼蟲的生長速率和成活率均顯著降低(P<0.05)(圖3)。

圖2 單獨投喂湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻和二者等比例混合投喂時幼蟲的生長與成活狀況不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05).

圖3 合浦珠母貝幼蟲攝食不同密度的湛江叉鞭金藻時的生長與成活狀況同一顏色柱狀圖上方不同字母表示差異顯著(P<0.05).

3 討 論

3.1 幼蟲對不同單胞藻的攝食與消化

本試驗中，各日齡幼蟲均能攝食小球藻、微綠球藻、湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻和球等鞭金藻，不攝食亞心形扁藻、三角褐指藻和小新月菱形藻，18日齡后部分或極少數(shù)幼蟲攝食杜氏鹽藻和牟氏角毛藻。這與企鵝珍珠貝幼蟲[20]、黃邊糙鳥蛤幼蟲[21]、扇貝幼蟲[22]、糙海參(Holothuriascabra)幼蟲[24]和珠母貝(Pinctadamargaritifera)幼蟲[25]等對單胞藻的攝食選擇類似。這些結(jié)果表明，幼蟲更容易攝食胞徑較小且呈圓形的單胞藻。隨著生長，幼蟲攝食能力逐漸增強(qiáng)[26]，因此在18日齡后有部分和極少數(shù)的幼蟲能夠攝食胞徑較大的杜氏鹽藻和牟氏角毛藻。角毛藻富含海洋無脊椎動物幼蟲正常生長發(fā)育所需的必需脂肪酸[27-29]，已在棘皮動物和雙殼貝類幼蟲培育中作為主要餌料或搭配餌料使用[25,30-31]。但在合浦珠母貝幼蟲培育中并不適口，牟氏角毛藻呈方形或長條形，雖規(guī)格僅為5 μm×7 μm，但其生有4根長達(dá)20～30 μm的角毛，阻礙了幼蟲的正常攝食[20,24,32]。胞徑較小的單胞藻比胞徑較大的單胞藻更易被幼蟲攝食，這與稚貝和成貝的攝食結(jié)果正好相反[33-34]。稚貝和成貝主要以鰓濾食，隨著單胞藻規(guī)格的增大從鰓絲漏掉的幾率也就降低，因此對胞徑較大單胞藻的攝食率高于胞徑較小的單胞藻[35]。而幼蟲階段主要靠纖毛的不斷擺動使單胞藻隨水流進(jìn)入幼蟲口溝而被攝食[26]。單胞藻胞徑大于幼蟲口溝時則不能流入，不規(guī)則或長條形的單胞藻只有與口溝存在一定的恰當(dāng)角度才能順利進(jìn)入口溝，因此幼蟲更易攝食胞徑較小、形狀呈球形、表面光滑的小球藻、微綠球藻、湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻和球等鞭金藻等。

本試驗發(fā)現(xiàn)，幼蟲對湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻、球等鞭金藻和杜氏鹽藻的消化率較高，但卻較難消化小球藻和微綠球藻。這與糙海參幼蟲[24]、扇貝幼蟲[22]、企鵝珍珠貝幼蟲[36]和美洲牡蠣(Crassostreavirginica)幼蟲[37]對類似單胞藻的消化結(jié)果相同。湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻、球等鞭金藻和杜氏鹽藻無細(xì)胞壁，在幼蟲胃內(nèi)經(jīng)機(jī)械作用和消化酶的作用下，易被裂解、消化并排泄；而同屬綠藻門的小球藻和微綠球藻具有一層纖維素細(xì)胞壁，很難被裂解和消化。未被消化的單胞藻在幼蟲胃內(nèi)微絨毛的擺動和胃自身收縮的條件下逐漸被排出。

3.2 不同投喂策略對幼蟲生長與成活的影響

培養(yǎng)期間，湛江叉鞭金藻與綠色巴夫藻混合投喂時，合浦珠母貝幼蟲的生長速率和成活率均顯著高于兩種單胞藻單獨投喂(P<0.05)，而綠色巴夫藻組又顯著(P<0.05)高于湛江叉鞭金藻組。就單胞藻混合投喂對幼蟲的生長和成活高于單獨投喂的效果，Martínez-Fernández等[12,15]在珠母貝幼蟲培育中得出相同的結(jié)論。通常認(rèn)為，多種單胞藻混合投喂避免了單一種類的營養(yǎng)不均衡，提高了餌料營養(yǎng)價值，更利于幼蟲的生長和成活。然而，并非所有的餌料種類搭配對幼蟲培育的生長和存活影響皆如此。Tang等[38]比較了球等鞭金藻及球等鞭金藻分別與杜氏鹽藻、亞心形扁藻和三角褐指藻混合投喂對文蛤(Meretrixmeretrix)幼蟲生長與存活的影響，發(fā)現(xiàn)3個混合藻組幼蟲的生長和成活并不比單獨投喂球等鞭金藻提高顯著，其原因可能與其選擇搭配的單胞藻種類有關(guān)。杜氏鹽藻、亞心形扁藻和三角褐指藻與球等鞭金藻混合投喂時，幼蟲對近乎球形且胞徑較小的球等鞭金藻攝食效率高于其他3種單胞藻，混合投喂時，幼蟲選擇性的攝食球等鞭金藻，未能達(dá)到混合藻營養(yǎng)物質(zhì)互補(bǔ)，提高其營養(yǎng)價值的效果。因此，在進(jìn)行單胞藻混合搭配投喂時，應(yīng)充分考慮單胞藻的形狀、胞徑大小、消化程度及營養(yǎng)物質(zhì)組成等因素，保障培育的幼蟲正常生長，提高成活率。

在一定密度范圍內(nèi)，隨著單胞藻投喂密度的增加，幼蟲生長速率和成活率均顯著降低。這與投喂餌料密度過高導(dǎo)致蛤仔(Venerupiscorrugata)幼蟲的生長速率與成活率[39]、文蛤的同化率[40]降低情況相似。鄧正華等[21,41]將黃邊糙鳥蛤幼蟲和珠母貝幼蟲放入105個/mL的單胞藻液中攝食1 h，發(fā)現(xiàn)幼蟲在高密度單胞藻水體中一次性攝食過多，胃內(nèi)單胞藻在微絨毛和胃自身收縮條件下，未經(jīng)完全消化即完整排出體外。同時幼蟲為了維持其對水的交換和自身浮游狀態(tài)，其纖毛一直維持著擺動和攝食狀態(tài)。因此，在幼蟲培育中，幼蟲一次性攝入過多單胞藻時，攝入的單胞藻未能充分被消化利用，也影響了幼蟲的生長和存活。