易建希

摘要：試驗(yàn)建立了飼料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的高效液相色譜測(cè)定方法。飼料中的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星用乙腈-磷酸鹽緩沖液（pH7.0）提取，混合型陽(yáng)離子固相萃取柱凈化，氨化甲醇溶液洗脫.0.025mol/L磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH至3.0）：甲醇：乙腈（82：7：11）作為流動(dòng)相，C18色譜柱進(jìn)行分離，檢測(cè)波長(zhǎng)為287nm。結(jié)果表明，在0.5～50.0μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999。該方法的檢測(cè)限為1.0mg/kg，定量限為5.0mg/kg。本法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于飼料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星;飼料;高效液相色譜法

1 引言

2015年9月中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布公告決定在食品動(dòng)物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2292號(hào)）。公告內(nèi)容：為保障動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全和公共衛(wèi)生安全，我部組織開展了部分獸藥的安全性評(píng)價(jià)工作。經(jīng)評(píng)價(jià)，認(rèn)為洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑可能對(duì)養(yǎng)殖業(yè)、人體健康造成危害或者存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》第六十九條規(guī)定，我部決定在食品動(dòng)物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥，撤銷相關(guān)獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)。因此本文建立了高效液相色譜方法對(duì)飼料中的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星進(jìn)行測(cè)定。

2材料與方法

2.1試劑與材料

除另有說(shuō)明外，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。磷酸二氫鉀;氫氧化鈉;甲醇：色譜純;乙腈：色譜純;磷酸：色譜純;三乙胺：色譜純;氨水：提取液：磷酸鹽緩沖溶液（取磷酸二氫鉀6.8g，加水使溶解并稀釋至500mL，用5.0mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0）375mL與125mL乙腈混勻;氨水一甲醇溶液：將30mL氨水與70mL甲醇混合均勻;對(duì)照品：洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星（純度≥98%）;對(duì)照儲(chǔ)備液：精確稱取對(duì)照品50mg（精確到0.1mg），用0.03mol/L氫氧化鈉溶液溶解并稀釋，該溶液濃度為1.0mg/mL;對(duì)照工作液：準(zhǔn)確移取適量對(duì)照儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相配成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0μg/mL; 0.22μm微孔濾膜;混合型陽(yáng)離子固相萃取柱（60mg/3 mL）。

2.2儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（配有紫外檢測(cè)器）：分析天平：感量0.00001g和0.001g;固相萃取裝置;旋渦混勻器;離心機(jī);恒溫振蕩器;氮吹儀。

2.3液相色譜條件

檢測(cè)波長(zhǎng)：287nm;色譜柱：C18柱，5μm，250mm*4.6mm;流動(dòng)相：移取1.7mL磷酸用水稀釋至1L，三乙胺調(diào)pH至3.0，并按82：7：11的比例和甲醇、乙睛混合，用前超聲脫氣5min;流速：1.0mL/min;進(jìn)樣量：20μL。

2.4樣品前處理

準(zhǔn)確稱取試樣2.0g，置于50mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入10.00mL提取液，振蕩搖床振蕩15 min。置于離心機(jī)中15000r/min離心10min，取上清液備用。用3mL甲醇、3mL水活化固相萃取柱，準(zhǔn)確移取5.00mL備用液過(guò)柱，用3mL水、3mL甲醇淋洗，真空抽干。3mL氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，于50℃下氮?dú)獯蹈伞?zhǔn)確移取1.00mL流動(dòng)相溶解殘留物，渦旋混合1min，過(guò)微孔濾膜后，供高效液相色譜分析。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將分別配制為0.5，1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別注入色譜儀，測(cè)定各濃度工作液的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6靈敏度的測(cè)定

稱取5份配合飼料各2.0g，按樣品處理方法測(cè)定，測(cè)得基線噪音值，按3倍信噪比計(jì)算，求得該方法的檢測(cè)限。

2.7 回收率的測(cè)定

稱取空白配合飼料2.0g，分別添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使得添加濃度分別為1.0，5.0，10.0mg/kg，每一濃度的樣品設(shè)置5個(gè)重復(fù)，按樣品處理方法測(cè)定，用外標(biāo)法根據(jù)峰面積計(jì)算其含量和添加同收率。

3結(jié)果

空白飼料、陽(yáng)性添加飼料、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星對(duì)照品溶液的液相色譜見

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

在選定的條件下，做定量校準(zhǔn)曲線。以洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的濃度對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1，表明洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星在0.5～50.0μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.2方法的檢測(cè)限

該方法測(cè)定洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的檢測(cè)限為1.0 mg/kg，定量限為5.0mg/kg。

4討論與分析

4.1波長(zhǎng)的選擇

由洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星在分光光度計(jì)的掃描圖可知，洛美沙星、氧氟沙星最佳吸收波長(zhǎng)為287nm，培氟沙星、諾氟沙星最佳吸收波長(zhǎng)為278nm。在278nm波長(zhǎng)處洛美沙星、氧氟沙星吸收值與培氟沙星、諾氟沙星吸收值相差較大，而在287nm波長(zhǎng)處培氟沙星、諾氟沙星吸收值與洛美沙星、氧氟沙星吸收值相差較小，因此確定最佳檢測(cè)吸收波長(zhǎng)為287nm。

4.2流動(dòng)相的選擇

洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星呈堿性，具有較強(qiáng)的極性，其在反相色譜上保留時(shí)間比較好控制。采用反相色譜時(shí)有機(jī)相的比例對(duì)洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的保留影響比較大，選擇合適比例的有機(jī)溶劑是很必要的。甲醇的洗脫能力低于乙腈，因此選擇乙腈作為有機(jī)相。隨著流動(dòng)相中乙腈比例的加大，洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的保留時(shí)間降低。但單獨(dú)使用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，等度或梯度流動(dòng)相中氧氟沙星、諾氟沙星出峰時(shí)間重疊，無(wú)法分離，所以用部分甲醇代替乙腈，作為有機(jī)相組成。為了避開色譜圖中氧氟沙星、諾氟沙星峰重疊的干擾，試驗(yàn)比較了多種不同甲醇、乙腈組成比例的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用流動(dòng)相組分為82%磷酸溶液：7%甲醇：11%乙腈的比例時(shí)，可有效洗脫洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星，并分離氧氟沙星、諾氟沙星組份，從綜合效率考慮此流動(dòng)相組成比例為最佳。

4.3提取溶劑的選擇

試驗(yàn)中采用了0.1mol/L氫氧化鈉溶液.磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0），0.1mol/L鹽酸溶液;0.025mol/L磷酸-三乙胺溶液（pH3.0），等作為提取溶液。通過(guò)試驗(yàn)比較各種溶液的回收率，磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）提取液能較好的減少雜質(zhì)對(duì)提取飼料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的影響，但同收率較低。為提高回收率，所以在提取液中加入乙腈，經(jīng)過(guò)比較從5%～50%乙腈比例，得出25%乙腈比例回收率最佳。

4.4凈化條件的選擇

洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星為堿性化合物，難溶于其他有機(jī)溶劑，通過(guò)比較HLB、C18、PCX、AluminumN、SCX、MCX、MAX 等固相萃取小柱的回收率和凈化效果，最終確定選擇回收率高，凈化效果好的混合型陽(yáng)離子固相萃取柱進(jìn)行凈化。

5結(jié)論

采用高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)測(cè)定飼料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星含量的檢測(cè)方法，在飼料中添加濃度為1.0，5.0，lO.Omg/kg時(shí)，測(cè)得洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的平均回收率分別為60.0%～95.0%，變異系數(shù)分別為1.0%～8.8%，各組分的檢測(cè)限為1.0mg/kg，定量限為5.0mg/kg。方法具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，定量限符合相關(guān)規(guī)定。

高效液相色譜法有“高壓、高速、高效、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣”的特點(diǎn)，最低一級(jí)基層實(shí)驗(yàn)室均可滿足本方法的實(shí)驗(yàn)條件，具有很高的推廣價(jià)值。但由于紫外檢測(cè)器本身的局限性，導(dǎo)致在檢測(cè)的過(guò)程中，可能存在假陽(yáng)性的問(wèn)題，就需要使用更高級(jí)的質(zhì)譜或者串接質(zhì)譜檢測(cè)器來(lái)做精確辨別。

參考文獻(xiàn)（略）