謝遇春，米 璐△，車天宇，奈日樂，馬麗娜，楊 峰，王志新，蘇 蕊，張燕軍，王瑞軍,，趙艷紅，王志英，何利兵, 劉志紅*，李金泉*

(1.內蒙古農業(yè)大學 動物科學學院，動物遺傳育種與繁殖自治區(qū)重點實驗室，農業(yè)部肉羊遺傳育種重點實驗室，內蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術研究中心，內蒙古 呼和浩特 010018;2.內蒙古金萊牧業(yè)科技有限責任公司，內蒙古 呼和浩特 010100)

烏珠穆沁羊為內蒙古特有品種，其肉質鮮嫩，而且耐粗飼，適合在天然草場放牧，素有“天下第一羊”的美譽。沙里[1]研究顯示烏珠穆沁羊中氨基酸含量豐富，尤其是8月齡烏珠穆沁羊氨基酸含量最高，且人體必需氨基酸異亮氨酸在8月份烏珠穆沁羊中積累最為豐富。眾所周知,肌肉除了水分之外主要由蛋白質組成，氨基酸組成不同導致蛋白質差異，而蛋白質的形成是一個復雜的轉錄翻譯的過程，故對不同部位肌肉進行蛋白質組成及差異探究對進一步探索肉質差異有著重要意義。

肉的顏色、系水力、pH、嫩度、風味及肌內脂肪含量是衡量肉品質的重要指標，而肌纖維類型對肌肉的pH，失水率，肉色等有著顯著的影響[2-5]。肌纖維類型可在代謝特征、收縮功能、肌球蛋白重鏈(MyHC)的多態(tài)性三個方面進行分類，根據(jù)其代謝特征可將肌纖維分為有氧代謝型和酵解代謝型。根據(jù)肌肉的收縮功能肌纖維可以分為Ⅰ型和Ⅱ型，依據(jù)肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MyHC)的多態(tài)性，可分為Ⅰ型、Ⅱa 型(快速氧化型)、Ⅱb 型(快速酵解型)和Ⅱx 型(中間型)[6-9]。而本研究意在利用各種影響肌肉品質的因素篩選影響肌肉品質的差異蛋白，為進一步探索其機制奠定基礎。目前，有關烏珠穆沁羊不同部位肉質的研究較少，采用液相色譜-質譜聯(lián)用技術[10-14]對烏珠穆沁羊的研究更是鳳毛麟角。為了揭示烏珠穆沁羊肌肉蛋白表達的差別及對應差異蛋白對該部位肉品質的影響，本研究采用SWATH方法，對烏珠穆沁羊背最長肌、臀部肌肉進行蛋白質定性和定量分析，找到了臀部肌肉和背最長肌總蛋白以及對肉質品質有顯著影響差異蛋白，同時也為肉品質的快速鑒定與溯源提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣本采自內蒙古烏珠穆沁旗，采集3只8月齡烏珠穆沁羊背最長肌與臀部肌肉兩個部位樣本。

1.2 試驗方法

1.2.1 總蛋白提取 取適量樣品置于液氮中研磨，加入1%SDS裂解液，室溫放置20 min，每隔1 min在渦旋儀上渦旋30 S，超聲破碎2 min，4 ℃，12 000 r/min 離心30 min，取上清。使用BCA(Bioteke)試劑盒進行總蛋白濃度測定。

1.2.2 總蛋白酶解 100 μg總蛋白加入200 μL 8 M尿素與10 mM DTT，37攝氏度變性1 h，12 000 rpm離心40 min，加入200 μL尿素、震蕩、12 000 rpm離心30 min重復兩次，加入200 μL 50 mM IAA避光反應30 min，12 000 rpm離心30 min。加入100 μL碳酸氫銨，12 000 rpm離心20 min，重復3次。加入適量trypsin 37 ℃孵育過夜。12 000 rpm離心30 min。加入50 μL碳酸氫銨，12 000 rpm離心30 min，重復2次。收集濾液，凍干，準備上機。

1.3.3 液相色譜質譜連用采集數(shù)據(jù) 取適量肽段凍干粉，A相復溶，上機獲取IDA與SWATH數(shù)據(jù)。離子源: IDA掃描模式:正離子;噴霧電壓: 2.3 kV;離子源溫度: 150 ℃。蛋白鑒定模式: 一級掃描模式: 全掃描; 一級掃描范圍: m/z 150～1 200; TO分辨率設為30 000; 選擇窗口: 0.4 Da；碎裂模式：CID; 碎裂能量: 動態(tài)碎裂; 二級掃描范圍: m/z 100～1 500; 循環(huán)模式: 動態(tài)排除掃描; 動態(tài)排除時間: 18 s; SWATH定量模式: 一級掃描模式: 全掃描; 一級掃描范圍: m/z 150～1200; TOF分辨率設為30 000; 間隔窗口25 amu; 碎裂模式: CID; 碎裂能量: 動態(tài)碎裂; 二級掃描范圍: m/z 100～1 500;循環(huán)模式: 依次均勻掃描。

1.3.4 生物信息學分析

1.3.4.1 蛋白鑒定 將液相色譜質譜連用采集的背最長肌肉與臀部肌肉IDA數(shù)據(jù)利用Protien Pilot4.5軟件進行搜庫，蛋白數(shù)據(jù)庫來源于UNIPROT/SWISS-PROT。

1.3.4.2 保留時間校準 利用Peak View軟件，對背最長肌肉與臀部肌肉的SWATH數(shù)據(jù)與IDA數(shù)據(jù)進行比對，進行保留時間校準，做定量分析。

1.3.4.3 差異蛋白的篩選 應用Marker View軟件的T檢驗繪制火山圖，篩選2組數(shù)據(jù)的PValue值與Fold Change的log值等兩個因素繪制，橫坐標代表差異倍數(shù)，縱坐標代表PValue值，且Fold Change以2為底的對數(shù)變換。以PValue值<0.05、差異倍數(shù)> 2或 < 0.5作為閾值選取背最長肌肉與臀部肌肉的差異蛋白。

1.3.4.4 在uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)中對差異蛋白查詢并注釋其功能。

2 結果與分析

2.4 總蛋白提取結果

取30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，電泳檢驗蛋白質提取效果如圖1所示。由圖1可以看出，蛋白質提取效果較好，上樣量一致，蛋白條帶均一，條帶清晰，說明蛋白濃度測定精準，可用于后期試驗。

圖1 SDS-PAGE電泳圖M.Marker蛋白分子量標準品；A.背最長肌肉；B.臀部肌肉；1-3代表生物重復Fig.1 Electrophoresis diagramM.Standard of Marker protein molecular A.Represents the longest muscle in the back;B.Represents the buttock;1-3. Represents the biological repetition

2.2 烏珠穆沁羊肉總蛋白鑒定

本研究以UniProt/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫為背景，對背最長肌和臀肌肌肉蛋白質進行鑒定，建立了背最長肌肉和臀肌肌肉的蛋白質表達譜。結果顯示，在1%假陽性條件下，共搜索到1003種蛋白質與18667種肽段，如圖2所示。

2.3 蛋白主成分分析

主成分分析是利用教學方法，將可能存在相關的一組蛋白質組數(shù)據(jù)轉化為一組不相關的新變量的分析方法[15]。在本次試驗中，樣本點之間距離越遠，說明蛋白表達差異越大。本試驗通過主成分析構建反應背最長肌和臀肌兩個部位差異蛋白質組的分析圖(圖3)，直觀地顯示了兩組分布在不同的區(qū)間，說明背最長肌與臀肌肌肉的蛋白質組成有較大差異。

圖2 總蛋白搜庫結果Fig.2 Result of database search

圖3 主成分分析a、b分別代表背最長肌和臀肌肌肉，1,2,3代表生物重復。Fig.3 Principal component analysisa and b represent the longissimus dorsi and gluteusmuscles respectively;1,2,3 represents biological duplication

2.4 背最長肌肌肉和臀部肌肉差異蛋白鑒定

如圖4所示，烏珠穆沁羊肌肉差異蛋白火山圖，共篩選出背最長肌和臀部肌肉的差異蛋白62個，在差異顯著的蛋白中上調為11個，下調為51個。

在上調的11個差異蛋白中分析了7個與肉品質關系較大的蛋白，結果表明 ：在代謝方面Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 1、Acyl-protein thioesterase 1及 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1蛋白主要參與長鏈脂肪酸的激活、脂肪代謝及氨基酸的修飾與調控；在肌肉收縮方面Parvalbumin alpha、30S ribosomal protein S6、Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 3 、蛋白主要參與肌肉運動，與鈣離子或肌動蛋白結合，使ATP合成或水解，為肌肉運動供給能量；在肌球蛋白重鏈多態(tài)性方面值得注意的是Myosin-2 heavy chain是一種與肌動蛋白結合的蛋白，具有由肌動蛋白激活的ATP酶活性，是肌纖維的組成性蛋白。

圖4 T檢驗樹狀圖Fig.4 T test tree

3 討 論

本研究對烏珠穆沁羊肉總蛋白鑒定，在1%假陽性條件下，共搜索到1003種蛋白質與18667種肽段。2017年Wang等[16]對豬背最長肌肉蛋白鑒定獲得969個蛋白，4815個肽段， 應用本技術獲得蛋白與iTRAQ技術一樣穩(wěn)定可靠。本研究篩選的上調蛋白共11個，其中7個是與肉品質相關的特征性蛋白，在代謝功能方面的蛋白：β氧化是脂肪代謝的一個重要途徑，而肌內脂肪的沉積又是影響肉品質的一個關鍵因素，例如fold change z中最高的蛋白Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 1主要參與β氧化[17]，而Acyl-protein thioesterase 1直接參與脂肪代謝，眾所周知肌內脂肪是影響肉品質的一個關鍵指標，而Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 1和Acyl-protein thioesterase蛋白又與脂肪的代謝息息相關，所以這兩個蛋白通過影響肌內脂肪的沉積而影響肌肉品質。蛋白質作為生理功能的執(zhí)行者[18]，蛋白組的變化可能與肉嫩度相關[19]，Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1蛋白其參與Ser/Thr-Pro修飾，并且在酪氨酸激酶的負調控中有至關重要的作用，絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸是蛋白質的重要組成成分，氨基酸變化則影響蛋白質的變化，Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1蛋白通過影響肌肉的嫩度從而影響肌肉品質。在收縮功能方面的蛋白，Parvalbumin alpha、30S ribosomal protein、Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 3這些蛋白可以與兩個鈣離子或肌動蛋白結合，與鈣離子共同作用于ATP，使ATP水解并釋放能量，或使肌動蛋白具有激活ATP酶的能力。汪以真[20]研究顯示:ⅡB 型肌纖維含量高的肌肉, 易發(fā)生PSE肉。I 和ⅡA 型肌纖維( 屬于氧化型肌纖維)含量高的肌肉表現(xiàn)出更好的感官品質。脂肪更易在這種類型的肌纖維肌肉中沉積, 并且因其含有較多的肌紅蛋白, 決定其肉質更好。更有研究顯示紅肌纖維收縮速度較慢，而白肌纖維收縮速度快，若紅肌纖維含量高白肌纖維含量低則肉質鮮美[21-22]，Parvalbumin alpha、30S ribosomal protein、Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 3蛋白作為在背最長肌肉中上調的蛋白若參與ⅡA肌纖維運動，則其紅肌纖維含量高，肌內脂肪沉積更多，則決定其肉質更為鮮美； Myosin-2 heavy chain蛋白，是肌球蛋白重鏈異構體，而肌原纖維由肌球蛋白和肌動蛋白組成，肌球蛋白又由肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈及兩個亞基組成[23-24], Stephen[25]研究顯示不同肌球蛋白重鏈會組成不同肌纖維類型，故Myosin-2 heavy chain蛋白直接影響肌纖維組成，最終決定肌肉品質。

4 結 論

1%假陽性條件下，檢測到1003種蛋白質與18667種肽段。選取差異系數(shù)大于2或小于0.05作為選取差異蛋白的閾值，差異顯著上調的蛋白有11個，下調為51個。上調的11個蛋白質在UniPort數(shù)據(jù)庫中檢索并分析，發(fā)現(xiàn)相較于臀部肌肉，背最長肌中有7個基因均與肌肉品質相關，并成功鑒定到?jīng)Q定肉品質的蛋白Myosin-2 heavy chain。