胡 丹，鐘金城*，柴志欣

(1.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南民族大學(xué) 成都 610041；2.西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，成都610041)

細(xì)胞色素b基因(Cytb)是哺乳動(dòng)物線粒體DNA(mtDNA)上一個(gè)重要的功能基因，編碼線粒體氧化磷酸化復(fù)合體III蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由379個(gè)氨基酸組成[1]，因其基因功能限制，具有較強(qiáng)的保守性，插入和缺失的變異很少出現(xiàn)在Cytb基因中，大多數(shù)堿基置換集中在轉(zhuǎn)換和顛換兩種情況，因而Cytb基因經(jīng)常被作為分析物種間遺傳進(jìn)化關(guān)系的重要標(biāo)記[2]，是最為理想的線粒體DNA遺傳標(biāo)記之一[3-5]。近年來基于mtDNA的基因研究被廣泛應(yīng)用于牦牛這一特殊物種上，姬秋梅等[6]通過對(duì)西藏牦牛Cytb基因的測(cè)序研究，系統(tǒng)闡述了西藏眾多牦牛類群的進(jìn)化地位和種內(nèi)遺傳多樣性；Cytb基因還被用于種間起源的研究當(dāng)中，李齊發(fā)等[7]通過對(duì)野牦牛和家牦牛這兩個(gè)親緣關(guān)系較近的物種的線粒體基因研究，證實(shí)了家牦牛與野牦牛在遺傳進(jìn)化關(guān)系上是由同一祖先進(jìn)化而來的觀點(diǎn)；涂世英等[8]對(duì)中甸牦牛Cytb基因進(jìn)行了測(cè)序，進(jìn)一步證實(shí)了牦牛不同類群間存在巨大的基因多態(tài)性差異。而mtDNA中的D-loop區(qū)與Cytb不同，其進(jìn)化速度快，變異較大，適用于對(duì)亞科內(nèi)屬、種間的系統(tǒng)學(xué)研究，郭松長(zhǎng)等[9]通過D-loop區(qū)部分序列的變異，對(duì)我國(guó)10個(gè)家牦牛品種間的遺傳多樣性、聚類關(guān)系進(jìn)行了分析；張成福等[10]對(duì)西藏牦牛的D-loop區(qū)序列進(jìn)行了測(cè)序，對(duì)其眾多類群的進(jìn)化分類進(jìn)行了不同角度的論證；汪琦等[11]測(cè)定了三江黃牛D-loop區(qū)部分序列對(duì)三江黃牛這一重要經(jīng)濟(jì)品種的系統(tǒng)進(jìn)化地位進(jìn)行了闡述。

塔什庫(kù)爾干牦牛主要分布于我國(guó)新疆塔里木盆地西部、帕米爾高原東部、青藏高原北部邊緣及塔吉克斯坦東北部海拔2 900～4 700 m的高寒草原草場(chǎng)及高寒草甸草場(chǎng)，屬役、肉、乳、毛皮兼用型的原始地方牦牛類群[12-15]，體格粗壯結(jié)實(shí)，毛色以黑、灰居多，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性好，是新疆帕米爾高原高寒地區(qū)農(nóng)牧民賴以生存的重要畜種[5]。本研究測(cè)定了10個(gè)塔什庫(kù)爾干牦牛個(gè)體的Cytb基因和D-loop區(qū)序列，通過克隆測(cè)序探討了新疆西部高海拔地區(qū)這一新的牦牛類群的遺傳多樣性和mtDNA分子進(jìn)化關(guān)系，為塔什庫(kù)爾干牦牛這一獨(dú)特遺傳資源的進(jìn)一步保護(hù)與開發(fā)利用提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在新疆自治區(qū)塔什庫(kù)爾干自治縣塔合曼鄉(xiāng)采集健康成年牦牛耳組織樣品10個(gè)(75°54'12"E,32°0′36′′N，數(shù)據(jù)來源于國(guó)家基礎(chǔ)地理信息中心，http://ngcc.sbsm.gov.cn/)。耳樣于75%乙醇溶液中保存帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總DNA提取、引物合成與PCR擴(kuò)增

使用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(TianGen)，提取牦牛耳樣DNA后產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè) DNA濃度和質(zhì)量。

參考涂世英等[8]、楊萬遠(yuǎn)等[16]對(duì)中甸牦牛和野牦牛Cytb基因設(shè)計(jì)的引物，其中F:5'-GTTCCGTAGCCATAGCCG-3'，R:5'-TTGAGTCTTAGGGAGGTT-3'，對(duì)塔什庫(kù)爾干牦牛細(xì)胞色素b基因進(jìn)行擴(kuò)增；參考郭松長(zhǎng)等[9]對(duì)家牦牛D-loop區(qū)序列設(shè)計(jì)的引物，其中F:5'-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3'，R:5'-GGGGTGTAGATGCTTGC-3'，對(duì)D-loop區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增?？侾CR反應(yīng)體系為25 μL，其中，上下游引物均為1 μL，模板DNA為1 μL，2×long Taq DNA預(yù)混酶12.5 μL，滅菌ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3.5 min；94 ℃變性45s；54 ℃退火50 s；72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

1.3 基因克隆及測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段大小后進(jìn)行膠回收，用DNA純化試劑盒分離純化后連接在PMD19-T載體上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到高敏感度感受態(tài)細(xì)胞DH5中，再涂于LB平板(20g/L X-Gal,10g/L IPTG,10g/L Amp)上培養(yǎng)12 h后，挑取單一白色菌落接種在LB(10g/L Amp)液體培養(yǎng)基上震蕩培養(yǎng)8 h，重組質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR后由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司測(cè)序[11]。

1.4 對(duì)比序列來源

從Genebank獲得的牛亞科代表物種以及綿羊作為外群體的序列來源見表1。

表1 牛亞科代表性牛種及外類群序列來源Table 1 The source of sequences in part of Bovinae varieties and outgroup

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯整理；再使用clustalX1.83軟件對(duì)同源序列進(jìn)行比較；使用DNAsp5.0軟件統(tǒng)計(jì)塔什庫(kù)爾干牦牛核苷酸多樣性(Nucleotide diversity)、單倍型多樣度(Haplotype diversity)和核苷酸單倍型數(shù)(Number of Haplotypes)，之后對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行Tajima's D中性檢驗(yàn)；使用MEGA5.0軟件，自舉分析(Bootstrap)采用1000次重復(fù)抽樣，按照Kimura-Two-Parameter模型計(jì)算遺傳距離，NJ(Neighbor Joining Method)法構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 Cytb基因與D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增

在普通牛mtDNA序列(Genebank Accession No.V00654)中，細(xì)胞色素b長(zhǎng)度為1 140 bp，塔什庫(kù)爾干牦牛PCR擴(kuò)增結(jié)果長(zhǎng)度為1 650 bp左右(圖1)，與參考序列比對(duì)后，完全比對(duì)上的序列長(zhǎng)度為1 140 bp，擴(kuò)增出Cytb基因。參考普通牛mtDNA全序列得知D-loop區(qū)序列長(zhǎng)度為898 bp，塔什庫(kù)爾干牦牛PCR擴(kuò)增結(jié)果長(zhǎng)度為 920 bp，將測(cè)序得到的序列與參考序列比對(duì)，完全比對(duì)上的長(zhǎng)度在 890～910 bp之間，擴(kuò)增出D-loop區(qū)序列。

2.2 塔什庫(kù)爾干牦牛mtDNA Cytb基因、D-loop區(qū)序列的遺傳多樣性

2.2.1 堿基序列組成 塔什庫(kù)爾干牦牛Cytb基因的全序列長(zhǎng)度為1 140 bp，個(gè)體間序列長(zhǎng)度無差異；T、A、G、C的含量分別為27.72%、33.21%、12.92%、26.15%；A+T含量為60.93%；G+C含量為39.07%，具有明顯的堿基偏好性。D-loop區(qū)序列全長(zhǎng)在890～910 bp之間，不同個(gè)體間存在序列長(zhǎng)度差異；4種核苷酸T、A、G、C的平均比例分別為26.12%、34.22%、25.27%、14.39%，；A+T含量為60.34%；G+C含量為39.66%，同樣存在明顯的堿基偏好性。

2.2.2Cytb基因和D-loop區(qū)序列的多態(tài)性 使用 DNAsp軟件計(jì)算塔什庫(kù)爾干牦牛Cytb基因序列的核苷酸多樣性(Nucleotide diversity)和單倍型多樣性(Hd)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP位點(diǎn)，全部為轉(zhuǎn)換，符合Cytb基因保守的特征；核苷酸多樣性(Pi)為0.00205，單倍型數(shù)(H)為3，其中Ta3～Ta10號(hào)樣本為一個(gè)單倍型， Ta2、Ta11號(hào)樣本各自為一個(gè)單倍型 (表2)，單倍型多樣性(Hd)為0.378；塔什庫(kù)爾干牦牛Cytb基因在581～1 026 bp之間有1個(gè)保守區(qū)域，在該保守區(qū)域內(nèi)，A、T含量為58.1%；Tajima為-0.21 206，中性檢驗(yàn)結(jié)果不顯著(P>0.10)。D-Loop區(qū)共統(tǒng)計(jì)出36個(gè)SNP位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)換11個(gè)，顛換21個(gè)，缺失3個(gè)，其核苷酸多樣性(Pi)為0.00 839，分析得到的單倍型數(shù)(H)為6，單倍型多樣性(Hd)為0.778，Tajima為-1.66 098，中性檢驗(yàn)結(jié)果不顯著(P>0.05)。

2.3 遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化分析

選取美洲野牛、西藏牦牛等牛亞科代表性牛種及測(cè)序得到的塔什庫(kù)爾干牦牛，共15個(gè)牛種，以綿羊作為外類群用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示塔什庫(kù)爾干牦牛首先與青海牦牛、巴州牦牛聚為一類，接著和西藏牦牛、野牦牛聚在一起，緊接著與美洲野牛聚在一起，普通牛、歐洲野牛和大額牛聚在一起后與牦牛一支聚在一起，而印度野牛與爪哇牛介于這兩支之間，牛亞科最外側(cè)為非洲水牛和亞洲水牛，犀牛、白犀牛、綿羊獨(dú)立于牛亞科物種之外?；贑ytb基因的牛亞種間遺傳距離見表3。由表3知，塔什庫(kù)爾干牦牛和巴州牦牛的遺傳距離最近為0.00115，其次是青海牦牛、西藏牦牛和野牦牛，分別為0.00345、0.00692和0.00808，最遠(yuǎn)的是犀牛0.23185，牛種間距離最遠(yuǎn)的是白犀牛和瓜哇牛，為0.24078。

選取麥洼牦牛、大通牦牛等牛亞科代表性牛種及測(cè)序得到的塔什庫(kù)爾干牦牛共14個(gè)牛種，同樣以綿羊作為外群體，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。在進(jìn)化樹中，塔什庫(kù)爾干牦牛首先與麥洼牦牛和大通牦牛聚在一起，并與青海牦牛、巴州牦牛聚為一類，之后再與西藏牦牛和野牦牛聚為一類，之后和美洲野牛、歐洲野牛聚在一起，牛亞種群體中最外側(cè)為亞洲水牛，最后與綿羊聚在一起。基于D-loop區(qū)的牛亞種間遺傳距離見表4。由表4知，塔什庫(kù)爾干牦牛和麥洼牦牛的遺傳距離最近為0.00 148，其次是大通牦牛、巴州牦牛和青海牦牛，分別為0.00 471、0.00 994和0.00 808，最遠(yuǎn)的是亞洲水牛0.15 199，牛種間距離最遠(yuǎn)的是亞洲水牛和普通牛，為0.16 466。

表4 牛亞科不同物種間Kimura雙參數(shù)遺傳距離(D-loop)Table 4 Kimura 2-parameter genetic distance among species in Bovinae(D-loop)

3 討 論

本研究首次以塔什庫(kù)爾干牦牛線粒體基因?yàn)檠芯繉?duì)象，測(cè)定了塔什庫(kù)爾干牦牛10個(gè)個(gè)體的Cytb基因與D-loop區(qū)全序列，對(duì)塔什庫(kù)爾干牦牛的遺傳多樣性與系統(tǒng)進(jìn)化地位做出了進(jìn)一步分析。經(jīng)測(cè)定，Cytb基因序列總長(zhǎng)度為1 140 bp，發(fā)現(xiàn)3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)且變異類型全部為轉(zhuǎn)換，符合Cytb基因保守的特點(diǎn)； A、T、G、C四種堿基的含量百分比分別為27.72%、33.21%、12.92%、26.15%，表現(xiàn)出一定堿基偏好性；單倍型的多樣性為0.2 571，核苷酸多樣性為0.00 035。 D-loop區(qū)序列長(zhǎng)度在不同個(gè)體間存在差異，長(zhǎng)度在890～910 bp之間，4種核苷酸T、A、G、C的平均比例分別為26.12%、34.22%、25.27%、14.39%，同樣表現(xiàn)出一定的堿基偏好性。與Cytb基因不同的是，D-loop區(qū)進(jìn)化速度快，變異較大的特性在本研究中也有所體現(xiàn)：本研究共統(tǒng)計(jì)出D-loop區(qū)序列中存在36個(gè)SNP位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)換11個(gè)，顛換21個(gè)，缺失3個(gè)，符合D-loop區(qū)序列的特征，也與汪琦等[11]對(duì)中甸牦牛D-loop區(qū)的研究結(jié)果相似；其單倍型多樣性(Hd)為0.778，核苷酸多樣性(Pi)為0.00 839，高于汪琦等[11]報(bào)道的中甸牦牛結(jié)果，表明塔什庫(kù)爾干牦牛種內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性，其群體變異也在中國(guó)地方牦牛類群中處于較高水平，同時(shí)，較高的單倍性多樣性及不均勻的核酸變異類型，說明塔什庫(kù)爾干牦牛群體內(nèi)存在兩種母系起源的可能性較大，這也與家牦牛具有兩種母系起源的研究結(jié)果吻合[11，17]。

圖2 NJ法構(gòu)建牛亞科系統(tǒng)發(fā)育樹(Cytb)Fig. 2 Neighborjoining tree reconstructed in Bovinae(Cytb)

圖3 NJ法構(gòu)建牛亞科系統(tǒng)發(fā)育樹(D-loop)Fig. 3 Neighborjoining tree reconstructed in Bovinae(D-loop)

本研究基于Cytb基因的牛亞科系統(tǒng)聚類分析得出，塔什庫(kù)爾干牦牛與巴州牦牛、青海牦牛聚為一類，接著與西藏牦牛和野牦牛聚為一類，表明塔什庫(kù)爾干牦牛與巴州牦牛和青海牦牛親緣關(guān)系近，原因可能與塔什庫(kù)爾干牦牛和巴州牦牛在地理位置上較近，使得其基因交流的機(jī)會(huì)大大增加，也與其生存環(huán)境相似有關(guān)，而大部分巴州牦牛、青海牦牛與野牦牛親緣關(guān)系較近，與近年來人為育種改良存在必然聯(lián)系。在基于D-loop區(qū)序列的牛亞科系統(tǒng)聚類分析中，塔什庫(kù)爾干牦牛首先與麥洼牦牛和大通牦牛聚在一起，并與青海牦牛、巴州牦牛聚為一類，之后再與西藏牦牛和野牦牛聚為一類，與Cytb基因中與青海牦牛和巴州牦牛親緣關(guān)系近的推論不同的是，雖屬于同一分支，但塔什庫(kù)爾干牦牛與麥洼牦牛和青海大通牦牛的遺傳距離更近，之后才與巴州牦牛和青海牦牛聚在一起，這一結(jié)果也與D-loop區(qū)序列變異速度較快，樣本數(shù)量少有關(guān)，但也進(jìn)一步說明了塔什庫(kù)爾干牦牛種內(nèi)遺傳多樣性的豐富性。Cytb基因與D-loop區(qū)的聚類分析同時(shí)表明西藏牦牛與野牦牛單獨(dú)聚為一類，和其他牦牛類群分開，也符合現(xiàn)有的家牦牛與野牦牛是同一祖先原始牦牛后代的起源觀點(diǎn)[18-24]，塔什庫(kù)爾干牦牛在與巴州牦牛、青海牦牛和西藏牦牛的系統(tǒng)進(jìn)化分析中表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，進(jìn)一步說明了這一新的牦牛類群在家畜遺傳資源的發(fā)掘過程中具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié) 論

本研究首次對(duì)塔什庫(kù)爾干牦牛10個(gè)個(gè)體的Cytb基因與D-loop區(qū)序列進(jìn)行了完整的克隆測(cè)序分析，對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化地位做出了闡述。塔什庫(kù)爾干牦牛具有作為我國(guó)地方優(yōu)良地方牦牛品種的遺傳資源潛質(zhì)，是寶貴的牦牛遺傳資源，其群體變異程度高，遺傳多樣性較為豐富，該結(jié)果可為塔什庫(kù)爾干牦牛遺傳資源的進(jìn)一步保護(hù)與利用提供理論基礎(chǔ)。