崔爽青，李勝利，孫海洲，金 鹿，桑 丹，張春華，張崇志，邴新帥，白 剛

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.鄂爾多斯市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

瘤胃微生物在反芻動(dòng)物消化、健康和免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1]，胃腸道微生物被視為反芻動(dòng)物的一個(gè)“微生物器官”，提供給宿主所不具備的消化代謝植物纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力[2]。原蟲(chóng)對(duì)小腸的蛋白質(zhì)供應(yīng)量已不同于以前低質(zhì)粗飼料水平下建立模型的估測(cè)量，瘤胃原蟲(chóng)在維持瘤胃內(nèi)穩(wěn)態(tài)和為動(dòng)物機(jī)體供應(yīng)能量和蛋白質(zhì)上發(fā)揮著重要作用。因此，瘤胃微生物特別是瘤胃原蟲(chóng)的組成和營(yíng)養(yǎng)代謝特點(diǎn)對(duì)于精準(zhǔn)養(yǎng)殖有重要的借鑒意義。

1 瘤胃微生物與瘤胃發(fā)酵

瘤胃是一個(gè)十分復(fù)雜的厭氧微生物發(fā)酵系統(tǒng)，這個(gè)微生態(tài)體系包括不同的原核微生物(細(xì)菌和古菌)、真核微生物(原蟲(chóng)和真菌)和噬菌體。這些微生物在瘤胃中主要占據(jù)著三個(gè)生態(tài)位：液相、食糜和消化道粘膜，75%以上的瘤胃微生物附著于瘤胃食糜和粘膜[3]。瘤胃中原蟲(chóng)數(shù)量雖然比細(xì)菌少得多，但是由于其體積較大，在瘤胃中的生物量可以達(dá)到10%～50%[4]。瘤胃內(nèi)的原蟲(chóng)主要屬于纖毛蟲(chóng)綱(Ciliates)均毛蟲(chóng)科(Holotrichidae)的絨毛蟲(chóng)屬(Dasytricha)和頭毛蟲(chóng)科(Ophryoscolecidae)的雙毛蟲(chóng)屬(Diplldinium)、內(nèi)毛蟲(chóng)屬(Entodinium)，其中以內(nèi)毛蟲(chóng)和雙毛蟲(chóng)最多，約占纖毛蟲(chóng)總數(shù)的85%～98%。

Russell[5]報(bào)道，在瘤胃微生物降解飼料過(guò)程中所產(chǎn)生的大量揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，經(jīng)瘤胃壁滲透進(jìn)入血液吸收后，可為反芻動(dòng)物提供50%～70%的能量需求。此外，反芻動(dòng)物機(jī)體60%～70%的蛋白需求，是由外流出瘤胃的微生物提供的。Bach[6]指出，外流出瘤胃的微生物蛋白總量的多少，依賴于瘤胃內(nèi)營(yíng)養(yǎng)底物的可利用性以及瘤胃微生物對(duì)于這些營(yíng)養(yǎng)底物的利用效率。多年以來(lái)，傳統(tǒng)的瘤胃代謝經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诜从碃I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解過(guò)程的復(fù)雜性和提高其利用效率方面，進(jìn)行了諸多有益嘗試。但不盡如意的是，這些模型受限于對(duì)不同日糧條件下瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量及其外流量規(guī)律的認(rèn)識(shí)不夠深入。

2 瘤胃內(nèi)原蟲(chóng)外流速率與蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)

在當(dāng)前奶牛和綿羊營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域，Dijkstra模型(1994)[7]和康奈爾凈碳水化合物和蛋白質(zhì)體系(CNCPS)[8]已被開(kāi)發(fā)用來(lái)提高日糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率及減少氮向環(huán)境中的排放。需要指出的是，這些模型的建立都是基于這樣一個(gè)概念，即瘤胃內(nèi)氮周轉(zhuǎn)(intra-ruminal N recycling)的增加是由于原蟲(chóng)的大量自溶引起，并且假定原蟲(chóng)很少甚至沒(méi)有外流出瘤胃。這些假設(shè)均建立在數(shù)量非常有限的體內(nèi)(invivo)試驗(yàn)觀測(cè)結(jié)果，有主觀臆斷之嫌，不免也就影響了這些模型對(duì)瘤胃代謝模擬的實(shí)效。Dijkstra 在其1994 提出的模型中，最初假定原蟲(chóng)外流出瘤胃的速率是固相流通速率(kp)的一半；而CNCPS 體系則假定沒(méi)有原蟲(chóng)外流出瘤胃[9]。1998 年版的Dijkstra 模型依據(jù)近幾年的大量報(bào)道，調(diào)高了此前版本所設(shè)定的原蟲(chóng)外流速率[10]。Hook[11]研究指出，Dijkstra1998 版模型在此方面的認(rèn)定是基于Bauchop與Clarke[12]在早期電子顯微鏡的研究結(jié)果，而且也未考慮吸附于瘤胃固相顆粒上的內(nèi)毛原蟲(chóng)量，如此一來(lái)出現(xiàn)了該模型低估了原蟲(chóng)代謝池的大小。Dehority[13]和Williams[14]研究指出，眾多學(xué)者基于對(duì)飼喂后瘤胃等毛原蟲(chóng)的行為研究結(jié)果，武斷地推測(cè)瘤胃中內(nèi)毛原蟲(chóng)亦有著相似的瘤胃“宅”(sequestration)現(xiàn)象。分析Prins等[15]在這方面的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)這些推斷大多來(lái)源于體外批次培養(yǎng)的研究結(jié)果。在體外批次培養(yǎng)情況下，累積的高濃度乳酸能夠溶解原蟲(chóng)細(xì)胞。Kebreab[16]撰文指出，目前基于原蟲(chóng)自溶的瘤胃建模，很可能夸大了原蟲(chóng)細(xì)胞在瘤胃內(nèi)的真實(shí)自溶量。在這方面，F(xiàn)irkins[17]進(jìn)一步指出，現(xiàn)有諸多模型版本中模擬原蟲(chóng)代謝動(dòng)力學(xué)，是完全基于綿羊和奶牛在低干物質(zhì)采食量(DMI)情況下的研究結(jié)果；現(xiàn)實(shí)情況是，當(dāng)奶牛DMI增加時(shí)，瘤胃固相外流速率(kp)也隨之增加，原蟲(chóng)細(xì)胞外流向小腸的速率亦同步增加，瘤胃原蟲(chóng)世代間隔會(huì)降低，原蟲(chóng)生長(zhǎng)效率加快；在上述兩方面的共同作用下，瘤胃內(nèi)原蟲(chóng)氮無(wú)效再循環(huán)將會(huì)降低；另外，原蟲(chóng)的外流還很可能受到固相顆粒的“表面附著”(apparent attachment)影響。多年以前，Bauchop和Clarke[12]利用掃描電鏡技術(shù)，觀察到在綿羊瘤胃內(nèi)前毛蟲(chóng)屬(Epidinium)原蟲(chóng)表面附著于飼草顆粒，并由此產(chǎn)生了“dogmas”這一瘤胃微生物學(xué)名詞，意指原蟲(chóng)附著于飼料和顆粒。從Williams 與Coleman[14]在這方面詳盡研究的思路來(lái)看， Dehority[18]完全忽視了原蟲(chóng)長(zhǎng)期附著飼料顆粒的重要生物學(xué)意義。Sylvester[19]和Karnati[20]的研究指出，瘤胃內(nèi)原蟲(chóng)的外流速率幾乎與瘤胃固相kp相當(dāng)。Sylvester等[21]在體外試驗(yàn)中也指出，原蟲(chóng)可根據(jù)轉(zhuǎn)化間隔調(diào)整其世代周期。

Dehority和Tirabasso[22]已充分研究揭示，等毛原蟲(chóng)具有識(shí)別糖濃度梯度變化的感知作用。盡管他們的結(jié)果顯示，由分子的化學(xué)感知(chemosensing)到原蟲(chóng)游動(dòng)之間有一定的時(shí)間間隔，但這足以表明此現(xiàn)象與細(xì)胞間糖原濃度變化相關(guān)。Leick和Lindemose[23]曾用“化學(xué)增活(chemokinesis)”一詞用于強(qiáng)調(diào)四膜蟲(chóng)(Tetrahymena)無(wú)方向性的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)。當(dāng)飼料被反芻動(dòng)物攝入到瘤胃中時(shí)，諸多以糖類、氨基酸和肽等形式存在的化學(xué)感應(yīng)因子亦隨之在瘤胃液中釋放。Williams和Coleman[14]報(bào)道，攝食后的奶牛瘤胃液中，等毛蟲(chóng)的化學(xué)感知作用將隨著糖的降解和貯存而降低，并停留在瘤胃中部。Russell[5]報(bào)道，較細(xì)菌而言，氨基酸和肽對(duì)瘤胃原蟲(chóng)生長(zhǎng)的刺激作用更明顯。Dehority[13]注意到，在充足供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)底物后，奶牛瘤胃內(nèi)的等毛原蟲(chóng)趨于下沉向性運(yùn)動(dòng)(ventral swimming)，當(dāng)其采食完后背向運(yùn)動(dòng)(dorsal swimming)，并且在不同的日糧類型下整個(gè)種群內(nèi)的絕大多數(shù)同步協(xié)作。這一點(diǎn)的研究對(duì)于瘤胃建模的意義非常重大，因?yàn)楸诚蛴蝿?dòng)可增加等毛原蟲(chóng)外流出瘤胃的機(jī)率。因此，對(duì)于內(nèi)毛原蟲(chóng)和等毛原蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，瘤胃外流速率的增加勢(shì)必會(huì)加快其生長(zhǎng)速率以補(bǔ)償增加的外流速率。

對(duì)于瘤胃原蟲(chóng)的研究，主要集中于全部或部分驅(qū)除原蟲(chóng)對(duì)于反芻動(dòng)物消化代謝的影響。樊艷華[24]匯總了1962～2012年國(guó)內(nèi)外關(guān)于瘤胃驅(qū)原蟲(chóng)來(lái)提高反芻動(dòng)物氮利用率的研究結(jié)果，總結(jié)得出驅(qū)原蟲(chóng)后有機(jī)物、中性洗滌纖維和粗蛋白在整個(gè)消化道內(nèi)的降解率都降低，有機(jī)物和中性洗滌纖維在瘤胃的降解率降低，瘤胃pH、NH3-N以及VFA降低，微生物蛋白的合成效率增加。Mosoni等[25]研究發(fā)現(xiàn)，短期(10周)驅(qū)原蟲(chóng)后分解纖維的菌群減少，日糧中纖維物質(zhì)的降解率降低，產(chǎn)甲烷菌減少，甲烷排出降低；而長(zhǎng)期(2年)驅(qū)原蟲(chóng)后分解纖維的菌群和產(chǎn)甲烷菌都增加。韓春艷等[26]、秦?zé)樫懙萚27]、經(jīng)語(yǔ)佳等[28]和趙士萍等[29]近年來(lái)也進(jìn)行了驅(qū)除原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)，得到了與之前學(xué)者類似的結(jié)果。驅(qū)除原蟲(chóng)對(duì)反芻動(dòng)物來(lái)講有利有弊，但他們都沒(méi)有考慮原蟲(chóng)蛋白對(duì)反芻動(dòng)物小腸蛋白質(zhì)的貢獻(xiàn)。

3 瘤胃內(nèi)原蟲(chóng)化學(xué)感知信號(hào)通路

反芻動(dòng)物對(duì)氮的利用率只有20%～35%，集約化牛羊養(yǎng)殖場(chǎng)相當(dāng)關(guān)注N的利用效率，因?yàn)檫@直接關(guān)系著養(yǎng)殖成本和環(huán)境壓力。有鑒于此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼開(kāi)發(fā)了諸如Dijkstra[10]和CNCPS等[8]知名模型并廣泛使用。這些模型對(duì)微生物N的外流速率及其外流小腸量的估測(cè)是既不準(zhǔn)確又不精確的，特別是對(duì)瘤胃中非液相階段的原蟲(chóng)數(shù)量幾乎未知。正如Firkins等[30]指出的，這些缺憾擴(kuò)大了對(duì)代謝蛋白質(zhì)(metabolizable protein，MP)量預(yù)測(cè)的邊際錯(cuò)誤。生產(chǎn)實(shí)踐中，為避免MP預(yù)測(cè)錯(cuò)誤，牧場(chǎng)主往往采用過(guò)量飼喂飼料蛋白質(zhì)的“矯枉過(guò)正”做法，造成N利用率下降、寶貴的蛋白飼料資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

多年來(lái)，國(guó)際上一些學(xué)者對(duì)非瘤胃原蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)化學(xué)感知作用及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)行了非常有益的探索，很有借鑒意義。Keizer-Gunnink等[31]和Leick等[32]報(bào)道，cGMP依賴性蛋白激酶G(PKG)與纖毛膜化學(xué)感應(yīng)相關(guān)，可刺激纖毛蟲(chóng)細(xì)胞生長(zhǎng)；阻斷cGMP激活的PKG，可導(dǎo)致纖毛蟲(chóng)的游動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)。Satir[33]指出，在這種因營(yíng)養(yǎng)梯度改變而發(fā)生的信號(hào)介導(dǎo)中，cAMP的水平升高與蛋白激酶A(PKA)和鈣調(diào)素活性增加關(guān)聯(lián)。Fukami等[34]發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)化學(xué)感知因子的誘導(dǎo)下，單細(xì)胞真核生物其細(xì)胞內(nèi)相對(duì)比胞外能適應(yīng)更高的Ca2+濃度。Bartholomew等[35]對(duì)四膜蟲(chóng)的研究發(fā)現(xiàn)，一些鈣依賴過(guò)程如β-微管蛋白(β-tubilin)的鈣調(diào)蛋白激活磷酸化可介導(dǎo)纖毛逆轉(zhuǎn)。Leick和Lindemose[23]認(rèn)為，葡萄糖和氨基酸營(yíng)養(yǎng)的化學(xué)感知作用，可激活原蟲(chóng)磷脂酰肌醇3-P 激酶(PI3K)-TOR 信號(hào)通路，促進(jìn)纖毛運(yùn)動(dòng)和相應(yīng)增加養(yǎng)分消化過(guò)程中的有效性。另外，相關(guān)研究亦顯示，蛋白激酶G(protein kinase G) 參與細(xì)胞膜信號(hào)傳導(dǎo)。

Lampert等[36]建立了非瘤胃纖毛原蟲(chóng)化學(xué)感知作用和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)及傳遞模型。在這一模型中，磷脂酰肌醇3-P激酶、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、蛋白激酶C、、二?；视?、肌醇1,4,5-三磷酸、亞硝基鐵氰化鈉(sodium nitropusside)、渥曼青霉素(wortmanin)、胰島素(insulin)等參與了調(diào)節(jié)作用，其中渥曼青霉素為PI3K的抑制劑，胰島素可以解救(rescue)渥曼青霉素對(duì)PI3K抑制作用，亞硝基鐵氰化鈉能夠激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(guanylyl cyclase)最終活化蛋白激酶G，染料木黃酮(genistein)為受體酪氨酸激酶的阻斷劑。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是一個(gè)包括許多脂質(zhì)激酶的家族，由1個(gè)調(diào)節(jié)亞基(P85)和1個(gè)催化亞基(P110)組成。mTORC1是mTOR的復(fù)合物之一，是一種重要的信號(hào)調(diào)控分子, 它通過(guò)磷酸化作用調(diào)控細(xì)胞內(nèi)mRNA的翻譯,參與膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)降解、蛋白激酶C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和核糖體合成。mTORC1可以對(duì)氨基酸、激素、生長(zhǎng)因子、葡萄糖產(chǎn)生應(yīng)答。它們通過(guò)mTORC1 信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)S6K1(ribosomal protein S6 kinase)和4E-BP1 (eukaryoticinitiation factor 4Ebinding protein 1)的磷酸化, 進(jìn)而從翻譯水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在細(xì)胞中，胰島素及胰島素樣生長(zhǎng)因子通過(guò)其受體及胰島素受體底物激活PI3K/AKT/mTORC1通路，而其他生長(zhǎng)因子多通過(guò)E-Ras激活PI3K/AKT/mTORC1通路。磷酸酶基因(PTEN)使磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)的D3位去磷酸化以抑制在PI3K的催化下磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)向PIP3的轉(zhuǎn)變。AKT在PIP3作用下向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，繼而被PI3K激活的PI3K依賴性激酶1(PDK1)同時(shí)磷酸化激活，直接磷酸化激活mTORC1。磷酸化的AKT還可以使TSC2磷酸化，抑制TSC2的活性，加速TSC1與TSC2的降解，這個(gè)過(guò)程引起mTORC1在TSC1-TSC2復(fù)合物抑制的狀態(tài)下釋放，從而激活mTORC1，增強(qiáng)其信號(hào)傳導(dǎo)通路。激活的mTORC1通過(guò)調(diào)節(jié)下游因子作用于基因的調(diào)控。

通過(guò)對(duì)非瘤胃原蟲(chóng)對(duì)碳水化合物和肽的化學(xué)感知作用的研究表明，瘤胃原蟲(chóng)這一單細(xì)胞真核生物存在營(yíng)養(yǎng)化學(xué)感應(yīng)(nutrient chemosensing)機(jī)制,并通過(guò)PI3K/AKT/mTORC1通路實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的細(xì)胞通信與感應(yīng)，以此來(lái)保障瘤胃發(fā)酵和機(jī)體穩(wěn)衡控制(homeostasis)。營(yíng)養(yǎng)化學(xué)感應(yīng)機(jī)制，是指通過(guò)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合, 或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)載體跨膜運(yùn)輸引起細(xì)胞體積和細(xì)胞膜電勢(shì)的變化。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)感應(yīng)受體能夠引起細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)表達(dá)和活性的改變。

瘤胃微生物把瘤胃發(fā)酵飼料產(chǎn)生的能量用于自身的生長(zhǎng)、維持、貯存糖原和能量溢出。能量的主要流向與微生物的生長(zhǎng)效率和飼料的營(yíng)養(yǎng)利用效率密切相關(guān)。在高精料日糧條件下，原蟲(chóng)可以將用于生長(zhǎng)和維持以外多余的碳水化合物合成儲(chǔ)備碳水化合物(貯存糖原)，供日后動(dòng)員使用或直接流到小腸被動(dòng)物機(jī)體吸收。另外，在碳水化合物嚴(yán)重過(guò)剩時(shí)將發(fā)生能量溢出[37]。原蟲(chóng)的自身維持和能量溢出不可逆地消耗ATP，減少了可用于蛋白質(zhì)合成的ATP，相比之下儲(chǔ)備碳水化合物存在著合成和降解的可逆關(guān)系，成為細(xì)胞內(nèi)的ATP的“緩沖池”(如圖1)。在生物界中，藍(lán)藻也存在類似的“溢出代謝”現(xiàn)象[38-40]。藍(lán)藻中的糖原合成和使用，是適應(yīng)光和養(yǎng)分可用性變化的常見(jiàn)機(jī)制，其糖原合成與光合作用和由glgC基因(slr1176)編碼的關(guān)鍵酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)有關(guān)。這對(duì)于研究瘤胃原蟲(chóng)對(duì)小腸蛋白質(zhì)的貢獻(xiàn)，提高能量利用率，重新準(zhǔn)確評(píng)估機(jī)體的能量利用率，有很大啟發(fā)。

圖1 瘤胃微生物ATP能量分配到生長(zhǎng)功能、非生長(zhǎng)功能和儲(chǔ)備碳水化合物Fig.1 Partitioning of ATP toward growth functions, non-growth functions, and synthesis of reserve carbohydrate

4 小 結(jié)

在現(xiàn)在高精料的飼養(yǎng)條件下，原蟲(chóng)的生物量隨之提高[41]，而瘤胃原蟲(chóng)可以貢獻(xiàn)高達(dá)50%的微生物生物量[42]，這使其成為流出瘤胃的微生物蛋白的重要組成部分。沿用以前低質(zhì)粗飼料條件下微生物對(duì)小腸蛋白質(zhì)的供應(yīng)量的估測(cè)方法，低估了瘤胃原蟲(chóng)對(duì)小腸蛋白的供應(yīng)量，造成了飼料粗蛋白的過(guò)量供給，從而造成寶貴的蛋白飼料資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。研究瘤胃內(nèi)原蟲(chóng)對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)化學(xué)感知作用，以及內(nèi)毛原蟲(chóng)、纖毛原蟲(chóng)等不同種屬原蟲(chóng)對(duì)于不同信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑感受差異以及相關(guān)分子機(jī)制，將有助于了解在瘤胃內(nèi)原蟲(chóng)在微生物功能中的重要作用，更好地預(yù)測(cè)瘤胃氮循環(huán)，減少糞尿氮的排放，提高反芻動(dòng)物氮的利用率。