柯娩英 ，楊治芳 ，周華華 ，孫靖 ，陳芳 ，吳文輝 ，劉鴻濱

(1、江西省撫州市第一人民醫(yī)院，撫州 344000；2、南昌大學第一附屬醫(yī)院，南昌 330006)

近年來發(fā)現，在人體外周血中存在一種骨髓源性的內皮祖細胞 （endothelial progenitor cells，EPCs），具有定向黏附至損傷血管壁修復損傷血管內皮的作用，對于維持血管結構和功能的完整性起著重要的作用[1，2]。 硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）是近年來廣泛受到大家關注的一種新型的氣體信號分子，研究證實，內源性或外源性H2S在保護心肌缺血損傷、再灌注損傷、抗高血壓、抗休克及在神經系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)中均具有重要作用[3，4]。我們既往研究發(fā)現，硫化氫能夠上調內皮祖細胞的生物學功能[5]，然而在高糖環(huán)境下，硫化氫是否能夠調控內皮祖細胞的功能活性及其可能的分子機制有待我們深入研究。本實驗擬在細胞水平，觀察硫化氫對高糖環(huán)境下EPCs的增殖、遷移、黏附能力，以及在糖尿病裸鼠頸動脈內膜損傷的模型中，觀察硫化氫預處理后EPCs的內皮損傷修復作用，研究其可能的分子機制；為外源性應用硫化氫調控內皮祖細胞治療糖尿病相關動脈粥樣硬化性疾病提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 EPCs的分離和培養(yǎng) 取來自撫州市第一人民醫(yī)院健康志愿者外周血作為EPCs來源：⑴正常健康人30例，所有采血者均排除吸煙、近期外傷手術史，簽署書面的知情同意書，并經倫理委員會批準。⑵外周靜脈血40ml與PBS緩沖液1：1稀釋后按2：1比例加入人淋巴細胞分離液，采用密度梯度離心法分離純化外周血單個核細胞；重懸于EGM-2培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素0.1mg/ml、VEGF 50ng/ml）， 接種于預先人纖維鏈接蛋白包被的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；3d后去除未貼壁懸浮細胞，更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)；每3d換液一次，在倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化，培養(yǎng)至7d左右的貼壁細胞即為實驗所用的內皮祖細胞。

實驗分組：將貼壁細胞隨機分為7組：⑴正常糖濃度（5.5mmol/L）：⑵高糖組（33mmol/L）；⑶高糖（33mmol/L）+不 同 濃 度 NaHS(25、50、100、200uM)組；⑷高滲透壓對照組：5mmol/L葡萄糖+35mmol/L甘露醇；培養(yǎng)24h，每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.2 EPCs的體外增殖實驗 取培養(yǎng)至第7d的EPCs進行增殖實驗：吸取培養(yǎng)液后用PBS沖洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶1ml 37℃消化5min，加入血清培養(yǎng)基終止消化，收集消化下來的細胞，1500rpm離心5min，PBS洗滌后離心2次，用2ml含10%胎牛血清EBM-2培養(yǎng)液稀釋后計數，根據計數結果將細胞濃度調整為3×104/ml的細胞懸液，取96孔板，吹勻細胞懸液，每孔加入細胞懸液100ul，加入干預藥物，放置于37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)，24h后，每孔加入CCK8 10ul，放置于37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)4h，將96孔板放置于酶標儀上選擇450nm處的吸光度，打印數據；

1.3 EPCs的體外遷移實驗 取培養(yǎng)第7d的EPCs進行遷移實驗；吸去培養(yǎng)液后用PBS沖洗兩遍，加入0.25%胰蛋白酶1ml 37℃消化5min；加入含血清培養(yǎng)基終止消化，收集消化下來的細胞，1500rpm離心5min；PBS洗滌后離心2次，用2ml PBS液稀釋后計數，根據計數結果將細胞濃度調整為3×105/ml的細胞懸液；取孔徑為8um的Tanswell小室，讓入24孔細胞培養(yǎng)板；下室加入含50ng/ml vascular endothelial growth factor(VEGF)的M199培養(yǎng)基；將細胞懸液吹勻，于上室每孔加入細胞懸液100μl；放置于37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h；取出Transwell小室讓入4%多聚甲醛固定30min；將Transwell小室放入DAPI染色5min；清水中洗凈多余的DAPI，棉簽擦去上室底部的細胞；鏡下計數隨機6個高倍視野（200x）的下室的貼壁細胞數量。

1.4 EPCs的體外黏附實驗 將培養(yǎng)的HUVECs胰酶消化后，按2×105/孔接種到4孔中培養(yǎng)48h后形成單層的內皮細胞層。EPCs熒光標記：將培養(yǎng)7d EPCs換液后，加入1ug/ml CM-DiI的無血清DMEM培養(yǎng)液37℃5min，4℃ 15min孵育后消化重懸；將消化重懸的EPCs按1×105/孔加入含內皮細胞單層的4孔板中，37℃靜置3h后將含有EPCs的培養(yǎng)液吸出，用PBS緩沖液輕輕漂洗3次，用4%多聚甲醛固定10min后用DAPI染核。然后在熒光顯微鏡下觀察，計算粘附于內皮細胞單層上的內皮祖細胞數量。

1.5 裸鼠頸動脈拉脫損傷模型 材料：健康8-10周雄性無胸腺裸鼠24只，重約16-18g，購自中山大學動物實驗中心，SPF動物房，生產許可證號：SCXK（粵）2017-0029。

1.5.1 手術 雄性裸鼠，以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，取頸部正中切口，從尾靜脈注射肝素鈉100u/kg。暴露左側頸總動脈和頸外、頸內動脈，用眼科剪游離出左側頸總動脈伴行的迷走和交感神經，完全分離約2.5cm，在頸外動脈下穿2根5-0絲線，2根絲線間距離大約0.5cm，結扎遠端。在2根絲線間剪開一小口，插入直徑0.35mm的金屬導絲至頸總動脈，旋轉進出3次以剝脫內膜。完成后結扎頸外動脈，觀察頸總動脈的搏動是否形成血栓，常規(guī)縫合皮下組織及皮膚。術中、術后給予肝素鈉抗凝各一次，術后常規(guī)青霉素抗感染處理。

1.5.2 內皮祖細胞的移植 將培養(yǎng)7d的志愿者外周血來源EPCs消化，PBS緩沖液重懸為密度5×105/100μl的細胞懸液置于37℃（EPCs示蹤實驗時EPCs先用CM-DiI標記），拉脫手術約3min后裸鼠蘇醒，將上述內皮祖細胞懸液按5×105每只從尾靜脈注入裸鼠體內，對照組用不含細胞的PBS緩沖液或HUVEs注射。

細胞移植分組：⑴空白對照組：PBS注射；⑵正常葡萄糖組干預組：5.5mmol/L孵育EPCs組；⑶高糖干預組：35mmol/L孵育 EPCs 24h移植；⑷200uM預處理12h+35mmol高糖干預組。

1.5.3 伊文思藍染色 將術后3d的裸鼠麻醉，經尾靜脈注入100ul的3%伊文思藍溶液，10min后打開頸部正中切口取雙側頸總動脈，處死動物；沖洗管腔后縱剖血管，內膜朝上置于載玻片，在體視學顯微鏡下觀察，剝脫面積為獲得動脈節(jié)段的總面積額，內皮再生面積為不被Evasns Blue著染得面積，并通過計算機圖像分析軟件Image-pro plus測定損傷總面積和內皮再生面積，計算內皮再生面積與損傷總面積比值。

1.6 蛋白檢測 采用Western blotting檢測NaHS干預前后EPCs目的蛋白的表達情況。培養(yǎng)7d后的EPCs經預冷的PBS洗滌后，用細胞裂解液于4℃裂解5min。將全細胞裂解產物經30x2s超聲后進行蛋白定量。取20μg蛋白進行SDS-PAGE并轉印至硝酸纖維素膜上，用Akt、p-AK2及eNOS、peNOS 相應的特異性一抗[Akt（1：2000）、p-Akt（1：2000）、eNOS（1：2000）、p-eNOS（1：2000）]單克隆抗體購買于Cell signal technology公司，以相應的熒光二抗和ECL蛋白印跡分析儀檢測目的蛋白。

1.7 統(tǒng)計分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行數據處理。計量數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，計數資料用率表示，組間比較用Chi-Square分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 培養(yǎng)7d的EPCs光鏡下圖片（100x）

圖2 培養(yǎng)7d的EPCs免疫熒光雙標（200x）

2 結果

2.1 EPCs的鑒定

2.1.1 EPCs倒置顯微鏡觀察形態(tài) 培養(yǎng)7d后的EPCs貼壁細胞呈現梭型、鋪路石樣（圖1），培養(yǎng)7d后的EPCs，用DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I進行免疫熒光鑒定，免疫熒光顯微鏡下觀察細胞攝取DiI-ac-LDL呈現紅色熒光，結合FITC-UEA-I呈現綠色熒光，DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I雙染色陽性細胞呈現黃色熒光，被認為是正在分化的EPCs（圖 2）。

2.2 EPCs體外增殖能力 用CCK8法檢測在高糖環(huán)境下，NaHS對EPCs的保護作用；與正常糖濃度組相比，高糖組的EPCs增殖能力明顯降低 (P＜0.05）。 20uM、50uM、100uM、200uM NaHS 作 用 后EPCs的增殖能力呈劑量依賴性升高 （P＜0.05），而高滲透壓對照組與5mmol/L葡萄糖組相比無顯著差異。

圖3 EPCs體外增殖能力

2.3 EPCs體外遷移能力 采用改良Boyden小室法，我們比較不同濃度NaHS預處理EPCs，在高糖環(huán)境下體外遷移能力的變化。與正常糖濃度組相比，高糖環(huán)境下EPCs的體外遷移能力明顯下降（P＜0.05），而 NaHS 預處理 EPCs后，在高糖環(huán)境下的遷移能力明顯得到恢復，并呈明顯劑量依賴性改變，而高滲透壓對照組與5mmol/L葡萄糖組相比無顯著差異。

2.4 EPCs體外黏附能力 通過內皮細胞黏附實驗，我們發(fā)現與正常葡萄糖處理組 （5mmol/L）相比，35mmol/L高糖組明顯降低EPCs的黏附能力（P＜0.05）；而高滲透壓對照組與5mmol/L葡萄糖組相比無顯著差異，NaHS預孵育的內皮祖細胞呈濃度依賴性恢復在高糖環(huán)境干預下的黏附能力（P＜0.01）。

2.5 EPCs在體再內皮化實驗 實驗中采用裸鼠頸動脈內皮損傷拉脫模型，我們將培養(yǎng)7d后的內皮祖細胞用CM-DiI標記，通過尾靜脈靜脈注射至裸鼠體內；3d后比較裸鼠頸動脈內皮損傷修復情況；結果顯示，EPCs移植與PBS注射組相比可促進損傷血管內皮再內皮化修復面積(P＜0.05)，而相比于正常葡萄糖孵育EPCs移植組，高糖環(huán)境孵育EPCs修復能力明顯下降（P＜0.01），采用 NaHS 預處理后，EPCs的內皮修復能力得到部分恢復（P＜0.01）；

2.6 Akt-eNOS信號通道的檢測 采用Western blot法，我們檢測EPCs Akt-eNOS蛋白表達情況，結果顯示，高糖35mmol/L干預下EPCs的p-Akt及peNOS蛋白表達水平較正常葡萄糖干預組明顯下降（xx vs xx，P＜0.05）；而單獨 200uM NaHS 干預組可明顯上調EPCs的p-Akt及p-eNOS蛋白表達水平（P＜0.01），并且部分修復在高糖環(huán)境下EPCs的p-Akt及p-eNOS蛋白表達水平。

圖4 EPCs體外遷移能力

3 討論

針對糖尿病合并動脈粥樣硬化性心臟疾病的治療，隨著干細胞研究的不斷深入，以干細胞為主要方式的新型治療模式—“治療性血管新生和血管修復”已成為醫(yī)學、生物學領域關注的焦點[1，6]?；A研究及臨床均顯示干細胞移植通過增強受損組織血管新生及受損血管內皮修復發(fā)揮治療作用。EPCs是一類具有高增殖潛能、能定向分化為內皮細胞的多能干細胞。它參與缺血后血管新生和受損血管的再內皮化，維持血管穩(wěn)態(tài)，在缺血組織及受損血管修復等生物工程方面有著良好的臨床應用價值。

然而干細胞移植還存在許多問題；其中最為重要的是干細胞移植后的在體生存率低下。絕大部分干細胞在移植后不能歸巢至受損組織，以及凋亡率過高；其原因上不明[7]；多數臨床研究表明，糖尿病患者中的危險因素如高血糖、高血脂、高胰島素血癥等導致EPCs功能活性下降及數量的減少，并且由于EPCs所在的內環(huán)境受到多種諸如高血糖、高血脂、高血壓等影響，其歸巢能力下降，很難歸巢至病變部分，通過增殖、分化發(fā)揮血管新生和血管修復的代償性作用，這也是單純外源性輸注EPCs治療效果欠佳的原因之一[8]。鑒于此，如何解決干細胞移植的治療性血管新生和血管修復療效不佳的問題，是干細胞移植由“實驗室”轉化之“臨床”重要一步，這對于改善糖尿病血管并發(fā)癥的治療有著重要的臨床應用價值。

圖6 再內皮化情況

注 ：A：正 常 糖 濃 度 （5.5mmol/L）；B：高 糖 組 （33mmol/L）；C：高 糖（33mmol/L）+200uM NaHS；D：200uM NaHS。

硫化氫（Hydrogen Sulfide，H2S）是一種無色、特征性臭雞蛋氣味、具有良好水溶性的可燃性氣體。近年來越來越多的研究證實，內源性H2S作為調節(jié)遞質可以發(fā)揮多種生物學功能，在動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、抗高血壓、抗休克及在神經系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)中均具有重要的病理生理作用。Yan等[9]在自發(fā)性高血壓大鼠的研究中發(fā)現，與正常對照組相比，實驗組大鼠血漿硫化氫表達水平明顯下降，并且胸主動脈內硫化氫活性降低、CSE mRNA水平表達下降，通過人工途徑干預硫化氫通路可誘發(fā)高血壓的發(fā)生，而給予外源性硫化氫可降低血壓，Yang等[10]通過敲除小鼠 CSE 生成基因（CSE-/-、CSE-/+）后，動脈血壓升高，進一步證明H2S/CSE系統(tǒng)參與了血壓的調節(jié)及其在高血壓發(fā)病中的重要性。Wang等[11]通過向載脂蛋白E基因敲除小鼠（ApoE-/-）體內注射外源性 H2S供體硫氫化鈉 （Sodium hydrosulfide，NaHS）能有效地抑制血管平滑肌細胞增殖、內皮細胞黏附分子表達及泡沫細胞形成等途徑阻止動脈粥樣硬化的發(fā)展，證明硫化氫與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有直接關系。

在我們前期研究中，硫化氫在非高糖環(huán)境下能夠明顯上調EPCs的增殖能力，而且其遷移及黏附能力均可得到進一步提高；本研究探討硫化氫是否具有抗高糖環(huán)境下內皮祖細胞的生物學功能下降以及介導的內皮損傷修復作用及可能分子機制。結果顯示，在高糖環(huán)境下EPCs的增殖、遷移及黏附能力較正常葡萄糖水平作用組明顯下降，而加入 NaHS（20、50、100、200uM）干預后，EPCs的上述生物學功能均得到一定程度的恢復，這種修復作用與NaHS的濃度有著明顯的濃度依賴性。Liu Fang等[12]發(fā)現硫化氫通過恢復內皮祖細胞功能及激活血管生成素1受體促進2型糖尿病小鼠的皮膚創(chuàng)面愈合作用。進一步研究發(fā)現在糖尿病小鼠下肢缺血模型中，通過提高體內硫化氫水平能夠促進骨髓干細胞的動員，進而發(fā)揮血管新生作用[13]；上述研究說明硫化氫可通過調控內皮祖細胞或者骨髓源祖細胞的功能變化發(fā)揮促進血管新生作用；而硫化氫是否能夠同樣能發(fā)揮在高糖環(huán)境下，通過改善內皮祖細胞的生物學功能發(fā)揮血管修復作用。本研究通過裸鼠頸動脈內膜損傷模型，觀察到高糖環(huán)境下孵育的內皮祖細胞通過尾靜脈途徑進行細胞移植，其發(fā)揮的內皮修復能力明顯低于正常葡萄糖孵育的內皮祖細胞移植組；NaHS預處理EPCs 12h后，再繼續(xù)于高糖環(huán)境下孵育24h后進行細胞移植，有趣的是，EPCs的再內皮化能力較單純高糖環(huán)境EPCs有了明顯的恢復，說明硫化氫可以恢復高糖環(huán)境對內皮祖細胞的損害作用。這與我們前期硫化氫預處理EPCs提高其再內皮化能力及歸巢能力相符合。

絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶 B（Akt）是一種分子量約為60kDa的蛋白，它是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）下游底物。PI3K/Akt信號系統(tǒng)廣泛存在于多種細胞中，參與細胞增殖、遷移、分化等調節(jié)功能[14，15]。研究發(fā)現PI3K基因的敲除鼠的Akt磷酸化降低，單側肢體缺血后新生血管形成減少，EPCs整合到內皮網絡及遷移的能力下降；eNOS是PI3K/Akt通路下游經典效應蛋白之一[16]。磷酸化的Akt有助于磷酸化下游區(qū)域底物內皮細胞一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS），促進eNOS活化和NO釋放；eNOS具有多種生物學功能：eNOS誘導血管內皮細胞產生的NO不僅在血管生成、調節(jié)血管張力上發(fā)揮重要作用，而且在抗動脈粥樣硬化，抑制血小板聚集和單核巨噬細胞黏附，以及抑制VSMCs增殖等過程中也起著非常重要的作用[17]。為了明確硫化氫在高糖環(huán)境下對內皮祖細胞的功能改善作用的分子機制，我們對高糖環(huán)境下EPCs和NaHS預處理EPCs的蛋白水平進行分析，結果發(fā)現，高糖環(huán)境下EPCs的磷酸化Akt和eNOS水平較正常葡萄糖干預組明顯下降，而NaHS預處理后，EPCs的p-Akt和p-eNOS水平均得到了一定程度的恢復，提示Akt/eNOS水平可能參與了NaHS發(fā)揮抗高糖環(huán)境下改善EPCs功能的作用。

綜上所述，本研究證實了高糖培養(yǎng)液作用下內皮祖細胞的增殖、遷移、黏附等生物血功能出現明顯下降趨勢，而給予外源性硫化氫預處理后，通過Akt/eNOS途徑發(fā)揮了上述生物學功能的部分上調作用，進而在體內實驗中也正是了經過NaHS預處理后EPCs的再內皮能力可得到進一步提高。本研究為探討硫化氫調控內皮祖細胞在高糖環(huán)境下的受損血管修復能力提供了理論依據和實驗基礎。