劉曉燕

（云南省楚雄州動物疫病預防控制中心 675000）

1 概述

馬傳染性貧血簡稱馬傳貧 (Equine Infectious Anemia，EIA)，又稱沼澤熱，是由馬傳染性貧血病毒引起的馬屬動物的一種傳染病，我國列為二類動物疫病，世界衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動物疫病[1]。其臨診癥狀是發(fā)熱、貧血、出血、黃疸、心臟衰弱、浮腫和消瘦等，并反復發(fā)作，發(fā)熱期（有熱期）臨診癥狀明顯，間歇期（無熱期）則臨診癥狀逐漸減輕或暫時消失；病毒可引起持續(xù)性感染和免疫病理反應。本病只感染馬屬動物，病馬和帶毒馬是主要的傳染源，其血液和發(fā)生病變臟器內含有大量病毒，隨分泌物和排泄物排出體外而散播，也可經被病毒污染的注射器和診療器械散播。馬屬動物中以馬最易感，驢、騾次之。任何年齡、任何品種的馬屬動物均可感染發(fā)病，以吸血昆蟲活動頻繁的夏季多發(fā)，主要通過虻、蚊、刺蠅及蠓等吸血昆蟲的叮咬而傳染。潛伏期長短不一，人工感染平均為10～30d，短的為5d，長的可達90d以上[2]。該病于1843年首次在法國發(fā)生，后隨兩次世界大戰(zhàn)而傳播到世界各地。1931年日本侵華時把此病帶入我國東北及華北等地，1954年和1958年由蘇聯(lián)進口馬匹時又將該病傳入我國，1966年后已蔓延到全國17個省市。為了防制馬傳貧，中央農林部（現(xiàn)在的農業(yè)部）于1972年在黑龍江召開了《馬傳染性貧血病防制工作座談會》，并以農林部 〔72〕農林（牧）字第38號印發(fā)了《馬傳染性貧血病的防制試行規(guī)定》，根據試行規(guī)定和云南省農業(yè)廳的布置，楚雄州于1978年制定了馬傳貧防治規(guī)劃，并于當年召開會議研究部署，舉辦化驗人員培訓班，并開展了大面積采樣檢測普查工作，并于1993年11月獲得馬傳貧防制工作經考核驗收達到穩(wěn)定控制標準。

為實現(xiàn)2016年底，全州達到并通過 “消滅馬傳貧達標”驗收標準這一目標，本研究從2014年連續(xù)3年組織開展了馬屬動物養(yǎng)殖情況調查和馬傳貧病流行病學調查等工作，為楚雄州消滅馬傳染性貧血提供參考依據。

2 材料與方法

2.1 樣品來源

本實驗所用樣品均來自楚雄州十縣（市），2014年送檢樣品2576份；2015年送檢樣品3106份；2016年送檢樣品3123份；3年共計8805份。

2.2 實驗試劑

哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司提供的馬傳染性貧血瓊脂擴散實驗抗原及馬傳染性貧血瓊脂擴散實驗陽性血清。

2.3 實驗設備

微波爐（合肥三洋榮事達電器有限公司，型號：EM-500S）、雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠，型號：SZ-93）、恒溫水浴鍋等，以上儀器均由楚雄州動物疫病預防控制中心獸醫(yī)實驗室提供。

2.4 實驗方法馬傳染性貧血瓊脂凝膠免疫擴散實驗法

2.4.1 范圍

本標準規(guī)定了馬傳染性貧血的瓊脂凝膠免疫擴散技術要求。

本標準適用于馬傳染性貧血的診斷和檢疫。

2.4.2 膠免疫擴散實驗

2.4.2.1 材料準備

抗原：檢測用抗原按說明書使用。

血清：（1）檢驗用標準陽性血清：能與合格抗原在12h內產生明顯致密沉淀線的馬傳貧血清，做8倍以上的稀釋仍保持陽性反應者為宜。小量分裝，凍結保存。（2）被檢血清：不含防腐劑和抗凝劑的被檢馬血清。

2.4.2.2 操作方法

（1）制備瓊脂板

取優(yōu)質瓊脂1.0g，直接放入含有萬分之一硫柳汞的100ml的PBS中，用熱水浴溶化混勻。

將直徑90mm的平皿放在上平臺上，每平皿倒入熱溶化瓊脂液20ml，厚度約2.5mm左右，注意不要產生氣泡，冷凝后加蓋，把平皿倒置，防止水分蒸發(fā)，放在普通冰箱中可保存兩周左右。

根據受檢血清樣品多少亦可采用大、中、小3種不同規(guī)格的玻璃板。10cm×16cm的玻璃板加注熱瓊脂液40ml；6cm×7cm的加注11ml；3.2cm×7.6cm的加注6m。（配成的瓊脂液，可裝瓶中用膠塞蓋好，以防止水分蒸發(fā)，待使用時，現(xiàn)溶化現(xiàn)制板）。

（2）打孔

反應孔現(xiàn)用現(xiàn)打。在坐標紙上畫好七孔型圖案。把坐標紙放在帶有瓊脂板的平皿或玻璃板下面，照圖案在固定位置上用金屬管打孔，將切下的瓊脂片取出，勿使瓊脂膜與玻璃面離動?？乖准巴庵芸卓讖骄鶠?mm，孔間距3mm（見附圖）。

附圖 七孔型

（3）滴加抗原和血清

在瓊脂板上端寫上日期及編號。在圖1七孔型的中央孔加抗原，外周2、4、6孔加檢驗用標準陽性血清，其余1、3、5孔分別加入被檢血清。加至孔慢為止，平皿加蓋。待孔中液體吸干后，將平皿倒置，以防水分蒸發(fā)；瓊脂板則放入濕盒中。置15～30℃條件下進行反應，逐日觀察3d并記錄結果。

2.4.2.3 結果判定

（1）陽性

當檢驗用標準陽性血清孔與抗原孔之間只有一條明顯致密的沉淀線時，受檢血清孔與抗原孔之間形成一條沉淀線；或者陽性血清的沉淀線末端在毗鄰的被檢血清孔向抗原孔側偏彎者，此種受檢血清判定為陽性。

（2）陰性

被檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線，或者標準陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線向毗鄰的受檢血清孔直伸或向受檢血清孔側偏彎者，此種受檢血清判定為陰性。

（3）疑似

標準陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線末端，似乎向毗鄰受檢血清孔內側偏彎，但不易判斷時應重檢，仍為可疑，判為陽性。

在觀察結果時最好從不同折光角度仔細觀察平皿上抗原孔與受檢血清孔之間有無沉淀線。為了觀察方便，可在與平皿有適當距離的下方，置一黑色紙等，有助于觀察。

3 結果

3.1 馬屬動物養(yǎng)殖及流行病學調查情況

為摸清楚雄州馬屬動物實際存欄數(shù)，為消滅凈化馬傳貧采樣提供依據，2014～2016年，全州每年組織開展一次馬屬動物入戶普查及流行病學調查工作，及時建立更新和完善馬屬動物養(yǎng)殖檔案（到戶花名冊），其調查情況詳見附表。

3.2 馬傳貧監(jiān)測工作開展情況

在馬屬動物入戶普查及流行病學調查的基礎上，從2014～2016年連續(xù)3年每年按存欄2%以上比例隨機不重復采樣要求，在楚雄州10縣（市）103個鄉(xiāng)鎮(zhèn)中采集馬屬動物血清，用瓊擴實驗方法進行馬傳貧監(jiān)測，3年累計在10個縣（市）、229個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）、508個村委會、6555戶養(yǎng)殖戶中監(jiān)測馬屬動物8805匹，占存欄2.54%，結果全部陰性。

4 討論

4.1 檢測方法

本研究所使用檢測馬傳染性貧血病的檢測方法是在國際貿易中的指定方法，瓊脂凝膠免疫擴散實驗 (AGID)[3]。該方法最早于1965年由解放軍獸醫(yī)大學首次分離馬傳貧病毒成功，進而成功研制了馬傳貧補體結合反應和瓊脂擴散反應兩種特異診斷法[4]。1975年哈爾濱獸醫(yī)研究所又研制成功了馬傳貧驢白細胞弱毒疫苗。本次實驗主要檢測馬傳貧的技術為哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的馬傳染性貧血?。ê喎Q馬傳貧?。┰\斷試劑，是用我國培育的馬傳貧驢白細胞弱毒疫苗株制作的抗原，具有特異、敏感、產量高和成本低等特點，并且能準確有效檢測出馬傳貧病強陽性、弱陽性和健康馬[5]。

4.2 范圍及結果

楚雄州馬傳貧普查和檢疫凈化工作從1978年至1992年，歷時15年開展了12次普查，覆蓋面達全州11縣（市）（包括祿勸縣在內）、163個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）、1487個村公所辦事處、16216個生產合作社，全州參加普查的畜牧獸醫(yī)科技人員達2006人次。采集馬屬動物血清用瓊擴實驗檢測130469匹，檢出陽性畜202匹，對檢出的202匹陽性畜全部進行撲殺及無害化處理。2014年至2016年，本研究按存欄2%以上比例隨機不重復采樣要求，在全州10縣（市）103個鄉(xiāng)鎮(zhèn)中采集馬屬動物血清，用瓊擴實驗方法進行馬傳貧監(jiān)測，3年累計在10個縣（市）、229個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）、508個村委會、6555戶養(yǎng)殖戶中監(jiān)測馬屬動物8805匹，占存欄2.54%，結果全部陰性。

5 結論

本研究從2014年連續(xù)3年組織開展馬屬動物養(yǎng)殖情況調查和馬傳貧病流行病學調查等工作，結果顯示，2014～2016年間未發(fā)現(xiàn)有臨床表現(xiàn)的病畜，提示從1985年開始開展畜禽及其產品檢疫起至今，楚雄州未發(fā)生過馬傳染性貧血病臨床病例；實驗室檢測結果顯示，2014～2016年間未檢測出陽性樣品，提示從1990年至今，楚雄州未檢出馬傳染性貧血陽性動物。研究結果為楚雄州消滅馬傳染性貧血提供了重要的理論參考依據。

附表 2014～2016年馬屬動物存欄情況表