張慧華 姜新華 方水晶

[摘要] 目的 探討人參皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用。 方法 采用羊肉湯二倍稀釋法測定人參皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用。 結(jié)果 本次研究共得44株標(biāo)準(zhǔn)株，其中陽性被膜菌株31例，被膜形成率為70.45%，編號(hào)為SA17的為強(qiáng)成膜菌株，MIC標(biāo)準(zhǔn)菌株20株，強(qiáng)成膜株SA17 41株；MBC標(biāo)準(zhǔn)菌株30株，強(qiáng)成膜株SA17 60株。藥物濃度3.2/1.6時(shí)，金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。藥物濃度100、50、25、12.5、6.3時(shí)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。人參皂苷能下調(diào)agr、sarA、fnbA基因表達(dá)，其中0.1、1.0、10.0濃度下調(diào)agr、sarA、fnbA基因表達(dá)，與對(duì)照相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 人參皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜具有顯著的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，其抑制率顯著增加。人參皂苷可下調(diào)agr、sarA、fnbA基因表達(dá)，減少細(xì)菌黏附性。

[關(guān)鍵詞] 人參皂苷；金黃色葡萄球菌；生物被膜；抑制

[中圖分類號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）22-0016-03

[Abstract] Objective To explore the inhibitory effect of ginsenoside on bacterial biofilm of Staphylococcus aureus. Methods The inhibitory effect of ginsenoside on Staphylococcus aureus biofilm was detected by two times dilution method of mutton soup. Results In this study， 44 standard strains were obtained， of which 31 cases were positive membrane strains. The membrane formation rate was 70.45%. Strong membrane strains were numbered SA17. There were 20 MIC standard strains and 41 strong membrane strains SA17. There were 30 MBC standard strains， and 60 strong membrane strains SA17. There was significant difference in inhibition rates of Staphylococcus aureus biofilm（P<0.05） when drug concentration was 3.2/1.6， while there was no significant difference in inhibition rates of Staphylococcus aureus biofilm（P>0.05） when drug concentration was 100， 50， 25， 12.5 and 6.3. Ginsenoside could reduce the expression of gene agr， sarA and fnbA， and the expressions of gene agr， sarA， fnbA， when the concentrations of ginsenoside were at 0.1， 1.0 and 10.0， were different from those of the control（P<0.05）， which were significantly different. Conclusion Ginsenoside has a significant inhibitory effect on Staphylococcus aureus biofilm， and the inhibition rate increases as the drug concentration rises. Ginsenoside can reduce the expressions of gene agr， sarA and fnbA， and decrease bacterial adhesion.

[Key words] Ginsenoside； Staphylococcus aureus； Biofilm； Inhibition

人參，微寒，屬于五加科人參屬植物。祖國傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，在治療感染性疾病時(shí)可加入人參，起到強(qiáng)身健體、提高抵抗力的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)[1]，人參皂苷能抑制蛋清所致的大鼠足腫脹，提高腎上腺。金黃色葡萄球菌是一種革蘭陽性桿菌，分布較廣，具有危險(xiǎn)致病性，約有30%[2]健康人群攜帶該病菌。金黃色葡萄球菌可引起機(jī)體感染，并加劇病情。生物被膜是細(xì)菌細(xì)胞為適應(yīng)環(huán)境變化，形成多聚物質(zhì)包裹并附著于生物體或分生物體表面的多層細(xì)菌構(gòu)成體。臨床共識(shí)生物被膜是細(xì)菌保護(hù)膜。85%金黃色葡萄球菌感染患者[3]可能形成生物被膜，并可出現(xiàn)持續(xù)性細(xì)菌感染，產(chǎn)生抗藥性。抑制金黃色葡萄球菌生物被膜形成是一種預(yù)防措施，目前對(duì)抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的研究主要集中在化學(xué)抑制劑及生長條件限制方面。金黃色葡萄球菌生物被膜最佳生長溫度為37℃，蔗糖及低濃度的氯化鈉能促進(jìn)金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。環(huán)式雙鳥苷酸能抑制金黃色葡萄球菌生物被膜形成，但抑制效果較差。本文主要探討人參皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人參皂苷購于浙江亞克藥業(yè)有限公司，國食健字G20060157，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)YBZ11372009，規(guī)格0.125 g/粒，共60粒。肉湯購于生物制品藥品檢定所（M-H肉湯），藥敏試驗(yàn)所用材料購于夏斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

藥敏試驗(yàn)：應(yīng)用試管二倍稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，試用藥物人參皂苷，以肉湯培養(yǎng)基溶解，制成40 μmol/L溶液，經(jīng)30 min培養(yǎng)，適應(yīng)0.22 μm過濾膜過濾，除去雜質(zhì)及細(xì)菌。使用肉湯進(jìn)行二倍稀釋，40、20、10、5.0、2.5、1.25、0.63、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0 mg/mL，將每次濃度體積設(shè)為4 mL，擬定3個(gè)平行，取對(duì)數(shù)生長期金黃色葡萄球菌菌液以肉湯稀釋（100倍），作為本次研究的接種溶液。在每個(gè)試管內(nèi)加入0.1 mL接種溶液，加入人參皂苷，放于37℃培養(yǎng)22 h，待試管內(nèi)溶液已經(jīng)完全澄清，立即測定OD600與只加菌，并與未加入藥物的試管內(nèi)溶液測定值進(jìn)行比較。

1.3評(píng)價(jià)指標(biāo)

生物被膜：應(yīng)用結(jié)晶紫染色法測定，將一定數(shù)量的接種溶液（3 mL）置于96孔板中，嚴(yán)格按照生物被膜測定步驟及方法進(jìn)行，每株菌3個(gè)復(fù)孔，取平均值。陰性株菌標(biāo)準(zhǔn)：OD595 nm≤0.11；弱成膜菌株標(biāo)準(zhǔn)：0.11～0.5 OD595 nm（含0.5 OD595 nm）；中成膜菌株標(biāo)準(zhǔn)：0.5～1.5 OD595 nm（含1.5 OD595 nm）；強(qiáng)成膜菌株標(biāo)準(zhǔn)：>1.5OD595 nm；實(shí)驗(yàn)菌選擇標(biāo)準(zhǔn)：強(qiáng)陽性菌株SA17。藥物最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）：加放人參皂苷的溶液與陰性對(duì)照一樣清晰透明為人參皂苷的MIC，與陰性對(duì)照一樣清晰的藥物接種溶液再次接種血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，以無細(xì)菌生長的含量最少溶液作為金黃色葡萄球菌的MBC。

人參皂苷最小抑膜濃度（sMIC）測定：（OD陰性對(duì)照組-OD藥物組）/（OD陰性對(duì)照組-OD空白組）×100%。

纖粘連蛋白黏附：應(yīng)用PeacokSJ（2000）法對(duì)纖粘連蛋白黏附進(jìn)行檢測，吸附值（A）=（每孔的實(shí)際吸收值-陰性對(duì)照孔的實(shí)際吸收值）×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究所有研究數(shù)據(jù)及資料均由參與人員共同收集完成，數(shù)據(jù)由3名數(shù)據(jù)處理經(jīng)驗(yàn)豐富的工作人員獨(dú)立錄入Epidata3.1軟件，并進(jìn)行校對(duì)；所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，樣本構(gòu)成比采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 臨床菌株生物被膜檢測結(jié)果

本次研究共得44株標(biāo)準(zhǔn)株，其中陽性被膜菌株31例，被膜形成率為70.45%，編號(hào)為SA17的為強(qiáng)成膜菌株，MIC標(biāo)準(zhǔn)菌株20株，強(qiáng)成膜株SA17 41株；MBC標(biāo)準(zhǔn)菌株30株，強(qiáng)成膜株SA17 60株。

2.2不同人參皂苷濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用

分析發(fā)現(xiàn)，藥物濃度3.2/1.6時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。藥物濃度100、50、25、12.5、6.3時(shí)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.3人參皂苷對(duì)預(yù)培養(yǎng)細(xì)菌基因表達(dá)量的影響

研究結(jié)果顯示，人參皂苷能夠下調(diào)agr、sarA、fnbA基因表達(dá)，0.1、1.0、10.0濃度下調(diào)agr、sarA、fnbA基因表達(dá)，與對(duì)照相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種重要的食源性致病菌，具有強(qiáng)大的生物被膜形成能力。細(xì)菌附著在生物或非生物接觸表面進(jìn)行生長，從而形成被膜。細(xì)菌被膜外基質(zhì)主要由糖、蛋白質(zhì)組成，這些物質(zhì)將細(xì)菌包裹，從而形成大量細(xì)菌聚集物。生物被膜中的細(xì)菌尤其是深層的細(xì)菌極不易被殺死或清除，形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，生物化學(xué)特征明顯，增殖與生長緩慢，對(duì)各種化學(xué)藥物的耐受性較高。機(jī)會(huì)致病菌金黃色葡萄球菌能夠寄宿在醫(yī)療器械及植入物上面，形成生物被膜，造成慢性感染。目前已能識(shí)別金黃色葡萄球菌生物被膜基因。金黃色葡萄球菌生物被膜能造成慢性感染，并影響疾病發(fā)展，阻礙疾病康復(fù)，還可導(dǎo)致細(xì)菌在微環(huán)境與宿主之間傳播，擴(kuò)散感染，加重病情。金黃色葡萄球菌生物被膜對(duì)抗生素具有極高的耐藥性，常規(guī)治療藥物作用不佳。因此，以金黃色葡萄球菌生物被膜為靶點(diǎn)的治療藥物，成為相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。目前西醫(yī)在控制金黃色葡萄球菌生物被膜方面主要有3個(gè)措施：（1）去除已經(jīng)形成的金黃色葡萄球菌生物被膜。（2）殺死金黃色葡萄球菌生物被膜中的微生物，以達(dá)到控制金黃色葡萄球菌生物被膜增殖的目的。（3）抑制金黃色葡萄球菌生物被膜形成。事實(shí)上，西醫(yī)一些措施既不能完全除去金黃色葡萄球菌生物被膜，也不能完全殺死金黃色葡萄球菌生物被膜中的微生物。中藥歷史悠久，對(duì)其藥理及作用進(jìn)一步研究有助于中藥事業(yè)的發(fā)展。西藥抗生素在治療感染性疾病中起到重要的作用，但我國抗生素濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，易產(chǎn)生耐藥性，不利于病情康復(fù)。如大環(huán)內(nèi)酯類抗生素雖具有較好的抗生物被膜特性，能快速參與免疫調(diào)節(jié)，減少感染，成為最常用的抗金黃色葡萄球菌生物被膜藥物。但長期服用西藥抗生素，依賴性較強(qiáng)，群體效應(yīng)不佳，還可引起其他革蘭陰性相關(guān)感染。因此，該采用何種有效藥物抗金黃色葡萄球菌生物被膜，預(yù)防其他革蘭陰性相關(guān)感染，成為臨床重點(diǎn)研究議題。本文認(rèn)為，選用具有抗菌作用的中藥成份，對(duì)臨床用藥起到重要的意義。單味人參皂苷中藥成份具有較好的抑菌作用。人參皂苷Rb1是從五加科中植物人參中提取的一種抑菌物質(zhì)，該物質(zhì)能通過抑制金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)熱抑制金黃色葡萄球菌能量代謝，從而達(dá)到抑制金黃色葡萄球菌的作用。尹良軍等[4]認(rèn)為，人參皂苷具有價(jià)格優(yōu)廉、毒副作用較小、耐藥少等優(yōu)點(diǎn)，能較好的抑制金黃色葡萄球菌增殖。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有多種耐藥性，給臨床診治帶來困難[5-10]。金黃色葡萄球菌生長至指數(shù)后期，菌體到一定濃度后[11-14]agr基因激活，fnb基因表達(dá)抑制[15-16]，從而降低金黃色葡萄球菌的黏附能力[17-19]。sar可與基因的啟動(dòng)子結(jié)合，激活其轉(zhuǎn)錄。sarA對(duì)fnb為正向調(diào)控。本文研究結(jié)果顯示，人參皂苷不直接影響金黃色葡萄球菌生長，而是通過減少細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)據(jù)，下調(diào)金黃色葡萄球菌黏附蛋白基因表達(dá)。抑制率在藥物濃度為3.2 mg/mL 及1.6 mg/mL時(shí)有差異（P<0.05），在濃度為100 mg/mL時(shí)抑制率最高，抑制率最大，表明不同濃度的人參皂苷對(duì)生物被膜的形成具有不同的抑制作用，抑制率隨著藥物濃度的增加而提高，對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的形成具有抑制作用有增強(qiáng)趨勢。

綜上所述，人參皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的形成具有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，其抑制作用越強(qiáng)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 回麗媛，李軍，朱明星，等. 抗菌肽17BIPHE2對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2017， 44（4）：872-880.

[2] 賀建忠，陳宏偉，王貴強(qiáng)，等. 金黃色葡萄球菌生物被膜形成與生物被膜相關(guān)基因的調(diào)查研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（4）：55-59.

[3] 張彩萍，謝家祺，濮娜，等. 雙黃連聯(lián)合萬古霉素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物被膜抑制作用的研究[J].中國醫(yī)藥指南，2016，14（7）：1-3.

[4] 尹良軍，周振旗，紹元，等. 鹽酸小檗堿、人參皂苷Rb1、黃芩苷及綠原酸對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用研究[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2016，22（24）：4969-4972.

[5] 李瓊，張愛華，鄭穎，等. 2種模式細(xì)菌對(duì)人參皂苷的化學(xué)趨向性響應(yīng)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（2）：121-123.

[6] Elmasri WA，Yang T，Tran P，et al. Teucrium polium Phenylethanol and Iridoid Glycoside Characterization and Flavonoid Inhibition of Biofilm-Forming Staphylococcus aureus[J]. Journal of Natural Products，2015，78（1）：2-9.

[7] 石文琪，張會(huì)彥，周強(qiáng)，等. 硝酸鈉對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響[J]. 食品研究與開發(fā)，2016，37（22）：10-14.

[8] 汪倫記，許美秋，糾敏，等. 冬凌草提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2017（6）：1000-1005.

[9] 潘翠珊，王風(fēng)華，翁藝芳，等. 人參皂苷Rg3脂質(zhì)體的處方優(yōu)化及制備工藝研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2015， 26（1）：113-117.

[10] Nostro A，Cellini L，Zimbalatti V，et al. Enhanced activity of carvacrol against biofilm of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis in an acidic environment[J]. Apmis，2015，120（12）：967-973.

[11] 侯雙利，韓梅，劉翠晶，等. 人參達(dá)瑪烷二醇合成酶基因的克隆、序列特征和組織表達(dá)分析[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，37（1）：57-62.

[12] 高鵬，程文曉，王開娟，等. 人參皂苷Rg1促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞增殖及骨向分化[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2015，31（1）：103-111.

[13] 張濤，韓梅，劉翠晶. 人參CYP716A53v2基因的克隆與序列分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016，44（6）：53-56.

[14] 謝媛媛，馮燕燕，曹便利，等. 基于生物膜色譜技術(shù)的人參類藥材特征指紋圖譜研究[C]//中國化學(xué)會(huì)全國質(zhì)譜分析學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)會(huì)議，2015.

[15] 劉喜華，黃敏琪，林忠文，等. 抗腫瘤藥物人參皂苷新型給藥系統(tǒng)研究進(jìn)展[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015， 21（9）：231-234.

[16] 劉妍，黃燕青，黃淑瓊，等. 人參皂苷對(duì)電壓門控離子通道的影響[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2015，29（1）：131-140.

[17] 濮燕屏，程惠娟，段強(qiáng)軍，等. 魚腥草素鈉聯(lián)合阿奇霉素對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜早期黏附的影響[J]. 中成藥，2015，37（8）：13-17.

[18] 王文東，郭雪芳，王曉麗，等. 桑螵蛸揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的體外抑制效應(yīng)的初步探究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2015，27（11）：50-52.

[19] 劉晶晶，陳晶瑜. 培養(yǎng)條件對(duì)金黃色葡萄球菌-大腸桿菌混合生物被膜的影響[J]. 中國釀造，2016，35（7）：20-23.

（收稿日期：2018-01-05）