魏民，徐凌燕，韓婕，徐燕，樊莉莉

(青海省人民醫(yī)院，西寧810000)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是一種雌激素依賴性疾病，雌激素可直接刺激異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖、促進(jìn)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移及多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，參與EMs的發(fā)病過(guò)程[1]。EMs異位病灶同樣也受到體內(nèi)雌激素的影響[2]，雌激素誘導(dǎo)的增殖和形態(tài)變化最終導(dǎo)致不典型增生，進(jìn)而可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌[3～5]。最近有研究報(bào)道，轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL6蛋白在EMs患者分泌期異位子宮內(nèi)膜組織中高表達(dá)[6]，且雌激素可通過(guò)活化G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(GPER)介導(dǎo)的IL-6/STAT3通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞SKBR-3增殖[7]。因此，我們推測(cè)雌二醇(E2)也可能通過(guò)上調(diào)異位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中BCL6蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖。2015年6月～2016年1月，我們觀察了E2對(duì)異位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞增殖及BCL6蛋白表達(dá)的影響，以及沉默BCL6蛋白表達(dá)對(duì)E2誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的影響，以期揭示E2誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 無(wú)菌Hank′s緩沖液(HBSS)購(gòu)自Hyclone公司；膠原酶Ⅳ、MTT購(gòu)自Sigma公司；Lipofectmine 2000、無(wú)菌篩網(wǎng)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、1%青鏈霉素、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；2 μg/mL氟康唑和BCL6蛋白抗體購(gòu)自BD公司；17β-雌二醇、RIPA裂解液購(gòu)自Abcam公司；β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；BCL6蛋白的小干擾RNA(siRNA)及其對(duì)照Scrambeld購(gòu)自上海吉瑪公司，BCL6 siRNA序列上游為5′-CGGCUCAAUAACAUCGUUATT-3′、下游為5′-UAACGAUGUUAUUGAGCCGTT-3′，Scrambeld序列上游為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′、下游為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 異位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的獲取與培養(yǎng) 收集2015年6月～2016年1月青海省人民醫(yī)院5例卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者的腹腔鏡手術(shù)切除標(biāo)本，并經(jīng)至少2位病理科醫(yī)生確診；患者年齡18～45歲，無(wú)其他重大內(nèi)科疾病及激素治療史。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。將標(biāo)本迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌操作臺(tái)中，使用無(wú)菌HBSS洗3次；無(wú)菌剪刀剪碎，用0.03%的膠原酶Ⅳ消化40 min；取出用無(wú)菌篩網(wǎng)過(guò)濾，將獲得的細(xì)胞濾液離心并重懸，進(jìn)行選擇性接觸來(lái)純化子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞。將獲得的細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素和2 μg/mL氟康唑的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，并放置在37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合度時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 E2對(duì)細(xì)胞增殖影響觀察 采用MTT法。收集異位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，置于不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中孵育12 h。將細(xì)胞分為兩組，干預(yù)組更換為含10 nmol/L的E2的DMEM/F12培養(yǎng)液，對(duì)照組更換為不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁后，用MTT法檢測(cè)24、48、72 h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞吸光度值，以此表示細(xì)胞增殖情況。

1.2.3 E2對(duì)細(xì)胞BCL6蛋白表達(dá)影響觀察 采用Western blotting法。取1.2.2中干預(yù)組干預(yù)0、24、48、72 h的細(xì)胞，冷PBS洗2次；RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離各組樣品，轉(zhuǎn)至PVDF膜以5%脫脂牛奶封閉；分別用BCL6蛋白和β-actin抗體孵育，以ECL發(fā)光液于曝光儀進(jìn)行顯影；Image J軟件分析蛋白條帶光密度，以目的蛋白與內(nèi)參條帶光密度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 沉默BCL6蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖影響觀察 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1×105個(gè)接種24孔板，待細(xì)胞貼壁至60%融合度時(shí)分為4組。A、B組均采用Lipofectmine 2000染試劑轉(zhuǎn)染BCL6-siRNA，C、D組轉(zhuǎn)染對(duì)照Scrambeld；轉(zhuǎn)染后，A、C組均更換為含10 nmol/L的E2的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h；采用MTT法觀察細(xì)胞增殖情況，方法同1.2.2。

2 結(jié)果

2.1 E2對(duì)細(xì)胞增殖的影響 見(jiàn)表1。

表1 E2對(duì)細(xì)胞增殖的影響

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05。

2.2 E2對(duì)細(xì)胞BCL6蛋白表達(dá)的影響 E2作用0、24、48、72 h時(shí)，干擾組細(xì)胞BCL6蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.17±0.03、0.19±0.02、0.57±0.06、1.14±0.12，48、72 h的BCL6蛋白相對(duì)表達(dá)量高于0 h時(shí)(P均<0.05)。

2.3 沉默BCL6蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響 見(jiàn)表2。

3 討論

EMs是性激素依賴性疾病，體內(nèi)激素水平能夠影響該疾病的發(fā)生進(jìn)展[8～10]。研究顯示，異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)和侵襲是EMs的主要特征，而子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞被認(rèn)為在此過(guò)程中起主要作用[11, 12]。近年來(lái)研究者認(rèn)為，EMs患者在位內(nèi)膜與異位病灶局部雌激素合成增加，促進(jìn)了在位與異位內(nèi)膜組織的生長(zhǎng)[13]，雌激素水平在EMs中起重要調(diào)控作用[1,12, 14]。雌激素能夠與子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞上的受體特異結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)一系列分子信號(hào)通路，參與EMs的發(fā)展[12]。孕激素、雄激素和促性腺激素釋放激素類似物等藥物可通過(guò)減少雌激素產(chǎn)生，抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其凋亡，現(xiàn)已與手術(shù)切除共同成為臨床上最常用治療手段[15～17]。本研究通過(guò)原代分離培養(yǎng)異位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，并采用10 nmol/L E2進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)E2可促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞增殖，與先前研究報(bào)道結(jié)論相一致[12]。然而，目前E2引起子異位宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞增殖的具體機(jī)制尚未完全闡明。

表2 沉默BCL6蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

注：與D組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

BCL6蛋白是轉(zhuǎn)錄抑制因子，是B細(xì)胞發(fā)育和腫瘤發(fā)生所必需的[4]。BCL6是人類原癌基因之一，可通過(guò)抑制p53和p300等基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖[5]。最近有研究報(bào)道，BCL6蛋白在EMs患者的月經(jīng)周期分泌期異位組織中高表達(dá)[6]；KRAS激活和SIRT1/BCL6過(guò)表達(dá)有助于EMs發(fā)病，并介導(dǎo)孕激素抵抗[5]。因此，我們推測(cè)BCL6蛋白表達(dá)是否與E2介導(dǎo)異位宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞增殖有關(guān)。本研究采用10 nmol/L E2干預(yù)異位宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中BCL6蛋白表達(dá)上調(diào)，表明BCL6蛋白表達(dá)水平與局部雌激素水平密切相關(guān)。此外，本研究采用siRNA沉默細(xì)胞中BCL6蛋白表達(dá)，并聯(lián)合E2刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BCL6 siRNA逆轉(zhuǎn)了E2對(duì)異位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，進(jìn)一步證實(shí)了BCL6在E2刺激誘導(dǎo)異位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞增殖中的作用。

目前，EMs的藥物治療主要是以抑制雌激素合成使異位內(nèi)膜萎縮、阻斷下丘腦卵巢軸的刺激和出血周期為目的的性激素治療，其僅適用于有慢性盆腔痛、痛經(jīng)癥狀明顯、有生育要求而無(wú)卵巢囊腫形成者，存在依從性差、易復(fù)發(fā)等問(wèn)題[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，E2可能通過(guò)調(diào)控BCL6蛋白介導(dǎo)異位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞增殖，因此BCL6蛋白可作為治療子宮內(nèi)膜異位的新靶標(biāo)。但是，我們僅研究了E2對(duì)BCL6蛋白表達(dá)的影響，其上游調(diào)控機(jī)制以及下游效應(yīng)途徑仍不清楚。今后我們將繼續(xù)探討具體上下游機(jī)制，以期為EMs的靶向治療提供新策略。