丁鑫，王乾印，馬亮亮

(青海紅十字醫(yī)院，西寧810000)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤。有統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全世界每年確診宮頸癌的人數(shù)達50萬，死亡者更是高達15萬，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。目前，綜合手術(shù)和放療為主、化療為輔的治療措施是宮頸癌的主要治療方案[2]。紫杉醇(PTX)是臨床應(yīng)用較廣泛的宮頸癌化療藥物，但長期用藥使宮頸癌細胞對PTX的敏感性降低導(dǎo)致耐藥[3]。腫瘤耐藥性產(chǎn)生與細胞凋亡異常有關(guān)，凋亡蛋白酶活化因子(APAF-1)、蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、Caspase1、Caspase3均為凋亡相關(guān)蛋白。因此，探究腫瘤細胞對PTX的耐藥機制并提高其敏感性是臨床化療亟待解決的重要問題。微小RNA(miRNAs)是非編碼RNA的一種，由18～25個核苷酸組成，通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合調(diào)控基因表達[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs異常表達與惡性腫瘤密切相關(guān)[5]，并且miRNAs可通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶蛋白的表達影響腫瘤細胞的抗藥性[6,7]。有研究表明，在卵巢癌細胞中miRNA-630(miR-630)表達量明顯上調(diào)[8]，抑制其表達能夠增加卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性[9]。2016年1月～2017年12月，我們通過抑制miR-630在宮頸癌細胞中的表達，觀察是否會對宮頸癌細胞PTX敏感性產(chǎn)生影響，并探討其機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 宮頸癌PTX耐藥細胞株HeLa-PTX，購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫；PTX購于美國Sigma公司。胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基及青霉素/鏈霉素(P/S)，均購于美國Gibco公司；miR-630小干擾RNA(siRNA)質(zhì)粒、對照空載質(zhì)粒，均購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，購于美國Ameresco公司；細胞凋亡試劑盒，購于上海碧云天公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染 將HeLa-PTX細胞置于5% CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱中，用含有10% FBS和1% P/S的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代。將HeLa-PTX細胞分為3組，抑制組和空載組根據(jù)Lipofectamine RNAi MAX試劑(Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染說明書分別轉(zhuǎn)染miR-630 siRNA質(zhì)粒、對照空載質(zhì)粒30 nmol/L，空白對照組不轉(zhuǎn)染，48 h后收集細胞。

1.2.2 細胞PTX敏感性觀察 采用MTT法。將各組細胞傳代接種于96孔培養(yǎng)板(8×103/孔)，24 h后加入終濃度為0、3、30、60、120、250、500、1 000 nmol/L的PTX，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。作用24 h后，根據(jù)MTT試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀上檢測各孔在490 nm的吸光度，測算細胞存活率。重復(fù)3次實驗。細胞存活率(%)=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%；使用SPSS統(tǒng)計軟件的概率單位法(PROBIT)確定半數(shù)抑制濃度(IC50)，以此判斷細胞對PTX的敏感性。

1.2.3 細胞miR-630和APAF-1 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。根據(jù)總RNA TRIzol試劑盒(Bioline公司)操作說明提取各組細胞的總RNA，并根據(jù)說明書提供的PCR系統(tǒng)將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA；引物序列由上海捷銳公司合成，使用Master Mix(Applied Biosystems公司)檢測相關(guān)基因的相對表達水平。APAF-1引物序列上游為5′-TGGAATGTCTCAAACGGTGA-3′，下游為5′-AAGCATTTTGCCATCTGGAG-3′；內(nèi)參β-actin引物序列上游為5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游為5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。miR-630引物序列上游為5′-GCGGCAGACACCACCAC-3′，下游為5′-GGCCGCTGCTATCGCTACTGAG；內(nèi)參U6引物序列上游為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；采用2-ΔΔCt方法表示APAF-1 mRNA和miR-630相對表達量。

1.2.4 細胞凋亡率測算 采用流式細胞術(shù)Annexin V/PI雙標(biāo)法。將各組細胞種于6孔板，根據(jù)FITC膜聯(lián)蛋白V凋亡檢測試劑盒(BD Biosciences公司)說明書檢測凋亡細胞，并用BD FACS Diva6.2軟件分析細胞凋亡率。重復(fù)3次。

1.2.5 細胞PARP、Caspase1、Caspase3檢測 采用Western blotting法。用冰冷的RIPA緩沖液(Thermo公司)裂解細胞。離心機降溫至4 ℃，以13 000r/min離心40 min;吸出上清液中的蛋白質(zhì)，并用10% SDS-PAGE分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司)，用5%脫脂乳-TBST在室溫封閉30 min。一抗4 ℃孵育過夜后，與HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗在室溫孵育1 h。根據(jù) Western BrightTMECL蛋白質(zhì)印跡檢測試劑盒(Advansta公司)說明書配制顯色液顯色。采用Bio-Rad公司圖像分析軟件，以目的蛋白與對應(yīng)內(nèi)參蛋白顯色條帶累積光密度比值表示目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞PTX IC50比較 抑制組、空載組、空白對照組PTX IC50分別為(35.61±2.87)、(142.57±3.63)、(144.31±2.42)nmol/L，抑制組PTX IC50低于NC組(t=-40.035，P=0.000)和空白對照組(t=-50.151，P=0.000)。

2.2 各組細胞miR-630和APAF-1 mRNA表達比較 與空載組及空白對照組比較，抑制組miR-630表達量降低(P=0.000)，而APAF-1 mRNA表達量增加(P=0.000)。見表1。

表1 各組細胞miR-630和APAF-1 mRNA相對表達量比較

注：與抑制組比較，*P<0.05。

2.3 各組細胞凋亡率比較 抑制組、空載組、空白對照組細胞凋亡率分別為19.60%±2.56%、10.20%±1.08%、8.00%±1.53%，抑制組細胞凋亡率高于空載組(t=7.565，P=0.000)和空白對照組(t=8.697，P=0.000)。

2.4 各組細胞PARP、Caspase1、Caspase3相對表達量比較 與空載組及空白對照組比較，抑制組PARP、Caspase1、Caspase3相對表達量增加(P均=0.000)。見表2。

表2 各組細胞PARP、Caspase1、Caspase3相對表達量比較

注：與抑制組比較，*P<0.05。

3 討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性健康，宮頸癌的治療方案一直備受矚目。晚期宮頸癌患者出現(xiàn)對化療藥物耐受，是導(dǎo)致病死率增加的主要原因。因此，探究宮頸癌細胞對化療藥物耐受的作用機制，提高化療藥物敏感性具有重要的臨床意義。

PTX是一種新型抗微管類藥物，在惡性腫瘤化療中應(yīng)用廣泛。PTX通過與β微管蛋白N端的氨基酸結(jié)合，破壞氨基酸的平衡，促進微管蛋白聚合，穩(wěn)定微管，抑制細胞有絲分裂，阻斷細胞周期，并誘導(dǎo)細胞凋亡[10]。有研究報道，miRNAs作為癌基因或抑癌基因參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，甚至能影響癌細胞對化療藥物的耐受性[11,12]。近年來，miR-630是腫瘤研究領(lǐng)域的熱門miRNAs之一[13]。研究顯示，miR-630高表達的腎細胞癌患者生存率降低[14]，miR-630高表達胃癌患者的預(yù)后更差[15]；Nam等[8]發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細胞中miR-630表達明顯上調(diào)，抑制miR-630表達能增加卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性[9]。本研究采用siRNA技術(shù)抑制HeLa-PTX細胞中miR-630表達后，宮頸癌細胞對PTX的敏感性增加。PARP是一種關(guān)鍵的DNA修復(fù)酶，參與DNA損傷應(yīng)答，并能調(diào)控細胞凋亡，維持基因組穩(wěn)定[16]。在帕金森小鼠模型中，Caspase1表達水平顯著增加[17]。王宇鋒等[18]研究表明，誘導(dǎo)細胞凋亡能上調(diào)Bax、Caspase3和PARP1蛋白表達。本研究中，抑制HeLa-PTX細胞中miR-630表達，可使PARP、Caspase1、Caspase3基因表達均增強，細胞凋亡率升高。由此推測，抑制miR-630表達可促進HeLa-PTX細胞凋亡，從而提高宮頸癌細胞對PTX的敏感性。Zou等[19]研究也證實，降低miR-630表達可抑制細胞增殖、侵襲并增強卵巢癌化療敏感性。

研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡減少是腫瘤耐藥性產(chǎn)生的基礎(chǔ)，APAF-1蛋白是線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白酶，線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路是細胞凋亡的主要形式，APAF-1是細胞凋亡的核心組成部分[20]。研究表明，在化療不敏感的腫瘤細胞中，APAF-1表達缺失或低表達[21]；而增加APAF-1表達，可增強腫瘤細胞的化療敏感性[22]。研究發(fā)現(xiàn)，APAF-1在HeLa-PTX細胞中表達水平低于HeLa細胞，提示APAF-1表達降低可能與宮頸癌細胞耐藥性有關(guān)。本研究在抑制HeLa-PTX細胞miR-630表達后，細胞內(nèi)APAF-1基因表達增加，提示miR-630和APAF-1基因表達之間存在相關(guān)性。miRNAs通過參與調(diào)節(jié)基因表達，在細胞多種生理病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究推測，miR-630可能直接或間接地參與了APAF-1基因調(diào)控，可為miR-630與宮頸癌化療敏感性的研究提供新思路，但具體調(diào)節(jié)機制還有待進一步研究。

綜上所述，在宮頸癌耐藥細胞株(HeLa-PTX)中miR-630呈高表達狀態(tài)、APAF-1呈低表達狀態(tài)，抑制miR-630表達可誘導(dǎo)細胞凋亡以及促凋亡蛋白表達，而降低APAF-1基因表達。這提示抑制miR-630表達能增強宮頸癌細胞對PTX的敏感性，可能是通過調(diào)節(jié)APAF-1基因表達實現(xiàn)的，miR-630具有作為逆轉(zhuǎn)宮頸癌耐藥靶標(biāo)的潛能。