聶俊，蔣鴻超，江波，何文杰，朱穎，董堅(jiān)

(1昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 云南省腫瘤醫(yī)院，昆明650118；2 昆明市兒童醫(yī)院)

三陰性乳腺癌(TNBC)占所有乳腺癌患者的15%～20%，以發(fā)病年齡輕、易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移和預(yù)后差為主要特征[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，而腫瘤壞死因子α(TNF-α)可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)，促進(jìn)EMT形成。在TNBC組織中NF-κB處于激活狀態(tài)，可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)TNBC的增殖及轉(zhuǎn)移[2，3]，而抑制NF-κB活性可降低TNBC的轉(zhuǎn)移能力[4]。目前，研究發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)不僅參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[5]，而且參與NF-κB通路活性的調(diào)控，并且其自身表達(dá)也受到NF-κB的調(diào)節(jié)[6]。miR-125b是一個(gè)炎癥相關(guān)的miRNA[7]，在乳腺癌中異常表達(dá)，參與乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥作用的調(diào)控[8]。2017年8月～2018年1月，我們觀察了抑制miR-125b表達(dá)對(duì)TNBC細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人MDA-MB-468細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，L15培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；TNF-α購(gòu)自美國(guó)R&D公司；miR-125b抑制劑(miR-125b inhibitor)、miR-NC陰性對(duì)照由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，脂質(zhì)體Lipofectamine LTX 和PlusTMReagent轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invtrgen公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司，TRIzol提取總RNA試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；SYBR Seclect Master Mix系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司；磷酸化NF-κB p65、E-cadherin和Vimentin一抗購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，二抗購(gòu)自美國(guó)Signalway公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 用含10% FBS的L15培養(yǎng)基體外培養(yǎng)MDA-MB-468細(xì)胞，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換液1次，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，融合率達(dá)90%時(shí)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將其分為抑制組、NC組、TNF-α和空白組。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與干預(yù) 用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/μL，接種于24孔板中(2 mL/孔)。24 h貼壁后換液，抑制組、NC組分別轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor和miR-NC。以不含血清的L15培養(yǎng)基稀釋的miR-125b inhibitor和miR-NC，取脂質(zhì)體Lipofectamine LTX 和PlusTMReagent轉(zhuǎn)染試劑稀釋到L15培養(yǎng)基中，輕輕混勻后在室溫下孵育5 min；將稀釋的Lipofectamine LTX 和PlusTMReagent分別與miR-125b inhibitor和miR-NC混合，輕輕混勻后在室溫下孵育20 min，以形成復(fù)合物；將復(fù)合物分別加入到抑制組、NC組細(xì)胞培養(yǎng)液中，將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，均加入TNF-α 10 ng/mL處理72 h。TNF-α組細(xì)胞不轉(zhuǎn)染，僅加入TNF-α 10 ng/mL處理72 h；空白組細(xì)胞不轉(zhuǎn)染、不干預(yù)。

1.2.3 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取6孔板，用Marker筆在其背面均勻劃?rùn)M線。用0.25%胰酶消化細(xì)胞，以5×105/孔鋪滿平板后，用20 μL槍頭沿橫線垂直劃痕。用PBS洗3次，去除劃下的細(xì)胞；加入無血清培養(yǎng)基，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在0、48 h觀察并拍照，觀察劃痕愈合情況，計(jì)算細(xì)胞劃痕遷移率。細(xì)胞劃痕遷移率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。用Matrige膠(Matrigel∶無血清培養(yǎng)基=1∶8)稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，于37 ℃ 30 min水化基底膜。將各組細(xì)胞于無血清培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)12 h，以5%胰酶消化細(xì)胞，每個(gè)侵襲小室上室加入1×104個(gè)細(xì)胞，下室加入含20%FBS的培養(yǎng)基600 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出下室基底膜，擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞。95%乙醇固定，蘇木素染色，置于倒置顯微鏡取隨機(jī)視野觀察照相并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞中miR-125b檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。TRIzol法提提取各組細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；采用SYBR Seclect Master Mix系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-125b，以U6作為內(nèi)參。miR-125b引物序列上游5′-ACTGATAAATCCCTGAGACCCTAAC-3′，下游5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCAC-3′；U6引物序列上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應(yīng)條件：25 ℃ 30 mim，42 ℃ 30 mim，85 ℃ 10 mim，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。數(shù)據(jù)通過Sequence detection software 1.3系統(tǒng)進(jìn)行處理，以2-ΔΔCT計(jì)算miR-125b相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 細(xì)胞中磷酸化NF-κB p65及E-cadherin、Vimentin蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。細(xì)胞裂解法提取細(xì)胞總蛋白，以BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入5×Protein Loading Buffer，煮沸5 min，使蛋白充分變性，-70 ℃保存。以β-actin為內(nèi)參，每個(gè)泳道40 μg蛋白量上樣，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉2 h；分別加入磷酸化的NF-κB p65、E-cadherin、Vimentin、β-actin一抗4 ℃孵育過夜；洗膜10 min×3次，二抗室溫孵育2 h；ECL后進(jìn)行曝光顯影，照片掃描后，用Image J軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度定量。以目的蛋白與β-actin蛋白條帶灰度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較 細(xì)胞遷移率及穿膜細(xì)胞數(shù)NC組、TNF-α組>空白組>抑制組(P均<0.05)，NC組、TNF-α組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與抑制組比較，#P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞中miR-125b及磷酸化NF-κB p65、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)比較 細(xì)胞中miR-125b及磷酸化NF-κB p65、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量NC組、TNF-α組>空白組>抑制組(P均<0.05)，E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量NC組、TNF-α組<空白組<抑制組(P均<0.05)，NC組、TNF-α組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞中miR-125b及磷酸化NF-κB p65、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與抑制組比較，#P<0.05。

3 討論

TNBC是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)均為陰性的乳腺癌，其惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、局部復(fù)發(fā)率高、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因[9]，因此，更好地了解轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要意義。

EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移早期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與腫瘤的發(fā)生、侵襲、復(fù)發(fā)和治療耐藥密切相關(guān)。有研究表明，TNBC較其他類型乳腺癌侵襲性強(qiáng)的原因與其發(fā)生EMT并獲得干細(xì)胞特性有關(guān)。腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞因子，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、TNF-α、白細(xì)胞介素6等均與EMT有關(guān)。其中，TNF-α參與腫瘤的發(fā)生、增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移和破壞免疫應(yīng)答[10]等多個(gè)步驟。研究表明，TNF-α可以由腫瘤細(xì)胞、腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在乳腺癌患者組織切片和血漿中TNF-α表達(dá)升高。TNF-α可激活NF-κB通路，通過Snail或ZEB1/ZEB2，抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)，從而誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT[11]。

NF-κB作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，在TNBC中存在持續(xù)性活化，可促進(jìn)EMT形成，引起乳腺癌的轉(zhuǎn)移。NF-κB是由Rel轉(zhuǎn)錄因子家族成員組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下，NF-κB蛋白在細(xì)胞質(zhì)中處于非活性狀態(tài)，與κB蛋白抑制劑(IκBs)結(jié)合。包括細(xì)胞因子在內(nèi)的多種因素可激活NF-κB，使其從IκBs中分離，隨后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程。包括NF-κB家族在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控miRNA的表達(dá)，且多種miRNA如miR-146[12]、miR-125[13]、miR-155[14]等可與NF-κB相互作用。一方面，NF-κB活化可調(diào)控miRNA的表達(dá)；另一方面，miRNA可通過其靶基因調(diào)節(jié)NF-κB的活性。NF-κB激活后，磷酸化的p65亞單位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到miR-125b的啟動(dòng)子上促進(jìn)miR-125b的表達(dá)[13]。miR-125b的靶基因NKIRAS2和TNFAIP3是NF-κB負(fù)性調(diào)節(jié)因子，miR-125b表達(dá)增加可反過來進(jìn)一步激活NF-κB，形成一個(gè)正反饋的調(diào)節(jié)通路[15]。研究表明，miR-125b的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-125b在胃癌組織及細(xì)胞中上調(diào)，通過下調(diào)胃癌細(xì)胞內(nèi)PPP1CA的表達(dá)，使Rb磷酸化增加，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；并且，miR-125b表達(dá)與腫瘤的大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[16]。

研究發(fā)現(xiàn)，TNBC細(xì)胞內(nèi)miR-125b的異常表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移[17]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，TNBC細(xì)胞MDA-MB-468和MDA-MB-231內(nèi)miR-125b表達(dá)高于三陽性乳腺癌細(xì)胞MCF-7和正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)，抑制MDA-MB-468細(xì)胞內(nèi)miR-125b的表達(dá)，可降低細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活性，抑制TNF-α引起的細(xì)胞遷移和侵襲，并使E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)、Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)，阻礙細(xì)胞發(fā)生EMT，從而降低NF-κB激活引起的侵襲。因此，干擾MDA-MB-468細(xì)胞內(nèi)miR-125b的表達(dá)，可能通過抑制NF-κB通路的活性，抑制細(xì)胞發(fā)生EMT，從而降低細(xì)胞的遷移及侵襲能力，為TNBC轉(zhuǎn)移的研究提供新的理論依據(jù)。