閆冰川，江鵬，江偉熾，洪健

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095

肝纖維化是指由肝炎病毒感染、酒精、寄生蟲等多種致病因素導(dǎo)致的肝內(nèi)纖維異常沉積與結(jié)締組織異常增生過程，是包括乙型肝炎，酒精性肝炎在內(nèi)的大多數(shù)慢性肝臟疾病的共同病理過程，并且最終可以發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[1～2]。我國是肝病大國，目前各類肝病人口約有2億[3]，其中相當(dāng)一部分伴有肝纖維化甚至肝硬化。但目前尚無非常有效的肝纖維化治療藥物，因此迫切需要研究開發(fā)新的抗肝纖維化藥物[4]。

苦參素是由中草藥苦參中提取分離的一種活性生物堿。研究顯示其對病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化以及肝癌均有一定的治療效果[5～7]。扁桃苷又名苦杏仁苷，是中藥苦杏仁及桃仁中的主要有效成分。報(bào)道顯示扁桃苷對肝纖維化也有一定的治療作用[8]。但目前尚不明確這2種藥物在治療肝纖維化方面是否具有協(xié)同作用。本研究利用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，以探討苦參素聯(lián)合扁桃苷對肝纖維化的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑 6周齡雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。CCl4和橄欖油購自國藥試劑公司，苦參素購自上海藍(lán)木化工公司，扁桃苷購自美國Sigma公司，天狼星紅染色試劑盒購自珠海貝索公司，羥脯氨酸檢測試劑盒購自英國Abcam公司，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒購自南京建成公司。實(shí)驗(yàn)所用CCl4用橄欖油稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2 模型制備及給藥方法 將40只小鼠隨機(jī)分為正常組5只、模型組5只、苦參素組10只、扁桃苷組10只、聯(lián)合治療組10只。其中正常組小鼠給予每周3次100 μL橄欖油灌胃，其他各組小鼠給予每周3次100 μL 40%CCl4(橄欖油稀釋)灌胃，誘導(dǎo)肝纖維化。灌胃持續(xù)8周，其中第5～8周按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別給予苦參素組、扁桃苷組和聯(lián)合治療組小鼠單藥或聯(lián)合用藥治療?？鄥⑺亟M小鼠給予200 mg/(kg·d)的苦參素灌胃；扁桃苷組給予200 mg/(kg·d)的扁桃苷灌胃；聯(lián)合用藥組小鼠同時(shí)給予200 mg/(kg·d)的苦參素和200 mg/(kg·d)的扁桃苷灌胃。苦參素使用生理鹽水溶解，配制成50 mg/mL濃度的工作液；扁桃苷難溶于水，使用0.5%濃度的羥甲基纖維素鈉水溶液配置成50 mg/mL濃度的懸濁液，于每次灌胃前經(jīng)超聲混勻；聯(lián)合用藥組藥物，先配制50 mg/mL濃度的扁桃苷懸濁液，再溶入苦參素，使苦參素的終濃度達(dá)到50 mg/mL。給藥期間，正常組及模型組小鼠每天給予等量生理鹽水灌胃。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測方法 于第8周結(jié)束后處死所有小鼠，保留肝臟組織新鮮組織標(biāo)本、石蠟標(biāo)本和血標(biāo)本用于檢測肝纖維化及相關(guān)指標(biāo)情況，比較不同治療方式的治療效果。其中新鮮組織標(biāo)本按照試劑盒說明書檢測羥脯氨酸濃度；石蠟包埋組織標(biāo)本切取4 μm后組織切片，按相應(yīng)試劑說明書行天狼星紅染色，按照Ishak標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肝纖維化評分[9]，并使用ImageJ軟件對天狼星紅染色切片中的膠原染色面積進(jìn)行定量。保存的血標(biāo)本按照試劑盒說明書檢測小鼠ALT和AST水平，用于評價(jià)小鼠肝功能水平變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以(±s)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況及體質(zhì)量變化結(jié)果比較 見圖1。正常組小鼠的體質(zhì)量呈逐漸增加的趨勢。與正常組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量明顯下降(P＜0.01)。與模型組比較，3組給藥治療小鼠精神、活動、毛色和飲食均有所改善，體質(zhì)量有所增長，但僅聯(lián)合用藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化結(jié)果比較

2.2 各組小鼠天狼星紅染色結(jié)果比較 見圖2、3。正常組小鼠無肝纖維化，Ishak評分為0，天狼星紅染色面積與羥脯氨酸占比較低；與正常組比較，模型組小鼠肝纖維化明顯，平均Ishak評分超過4分，天狼星紅染色明顯，羥脯氨酸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組比較，苦參素組、扁桃苷組、聯(lián)合用藥組在肝纖維化Ishak評分，天狼星紅染色面積和羥脯氨酸占比方面均有明顯改善，以聯(lián)合用藥組改善最明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖2 各組小鼠肝臟組織切片典型天狼星紅染色結(jié)果比較（×100）

圖3 各組小鼠肝纖維化Ishak評分、天狼星紅膠原染色面積及羥脯氨酸檢測結(jié)果比較

2.3 各組小鼠血ALT、AST變化結(jié)果比較 見圖4。與正常組比較，模型組小鼠的血ALT和AST均明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，各給藥組小鼠血ALT、AST均有一定程度的下降，以聯(lián)合用藥組效果最明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 各組小鼠血ALT與AST變化結(jié)果比較

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)生發(fā)展過程中伴隨的肝臟基質(zhì)與纖維成分異常沉積的病理過程。在各種肝損傷因素的長期作用下引起的慢性肝炎肝損傷，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞激活、增殖并分泌產(chǎn)生大量的基質(zhì)成分，導(dǎo)致肝纖維化，并可以進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化和肝癌[4]。肝纖維化發(fā)病率較高，并且可以發(fā)展為肝硬化和肝癌，是一種嚴(yán)重危害人民群眾身體健康的疾病。雖然有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些具有一定抗肝纖維化作用的藥物，但到目前為止尚無非常理想的抗肝纖維化治療藥物。因此探索多藥聯(lián)合的抗肝纖維化治療方案，提高藥物治療肝纖維化的效果，具有重要的研究意義。本研究通過CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型，證實(shí)了苦參素與扁桃苷聯(lián)用可以有效的減輕實(shí)驗(yàn)小鼠的肝纖維化程度，有明顯的肝纖維化治療效果。

本研究驗(yàn)證了苦參素與扁桃苷的抗纖維化作用，同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了這2種藥物聯(lián)用具有更顯著的抗肝纖維化治療效果。但目前對于這2種藥物的抗肝纖維化分子機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究確定相關(guān)機(jī)制。同時(shí)也需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)，評估這2種藥物聯(lián)用的實(shí)際臨床應(yīng)用價(jià)值。