徐玉輝，高英杰，時宇靜，孫靜，毛鑫，王彥禮，曲天歌，崔曉蘭

1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700

艾康臨床經(jīng)驗方原方由川芎、茯苓、甘草、靈芝、金銀花、野菊花、苦參等13味藥組成。艾康去苦參方由不含苦參的其它12味藥組成，以避免苦參中含有的苦參堿、槐定堿、金雀花堿等毒性成分。目前缺乏艾康臨床經(jīng)驗方用于治療腎炎的研究，尤其是缺乏組方中的苦參在治療腎炎時的功效研究[1～2]。已知腎炎的病因有很多，但是主要以細(xì)菌性腎炎和免疫性腎炎為主[3～4]。本研究分別以大腸桿菌(E.coli)導(dǎo)致的細(xì)菌性腎炎大鼠模型和日本大耳白兔急性血清病腎炎模型為研究對象，以比較含苦參和去苦參組方在腎炎模型中的藥效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級雄性健康SD大鼠，70只，體質(zhì)量(220±10)g，購自北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、阿莫西林組、原方大劑量組、原方小劑量組、缺苦參大劑量組、缺苦參小劑量組，每組10只。

日本大耳白兔(普通級)，42只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄各半，購自北京金牧陽實驗動物公司，動物許可證號：SCXK(京)2015-0005。隨機(jī)分為正常組、模型組、雷公藤片組、原方大劑量組、原方小劑量組、缺苦參大劑量組、缺苦參小劑量組，每組6只。

1.2 實驗藥物及給藥 艾康片(批號：20170223-5)和艾康缺苦參樣品(批號：20170217)由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥制劑研究中心生產(chǎn)。生藥量都為：1 g/mL。原方樣品使用的大、小劑量分別為大鼠1.4 g/(kg·d)和0.7 g/(kg·d)，日本大耳白兔0.8 g/(kg·d)和 0.4 g/(kg·d)，相當(dāng)于人 0.25 g/(kg·d)和 0.13 g/(kg·d)。缺苦參樣品使用的大、小劑量分別為：大鼠1.2 g/(kg·d)和0.6 g/(kg·d)，日本大耳白兔 0.72 g/(kg·d)和 0.36 g/(kg·d)，相當(dāng)于人 0.23 g/(kg·d)和 0.12 g/(kg·d)。阿莫西林(感染模型的陽性藥)為哈藥集團(tuán)制藥總廠產(chǎn)品，產(chǎn)品批號：A1611005，規(guī)格0.5 g。人的使用劑量為0.03 g/(kg·d)；大鼠的使用劑量為0.18 g/(kg·d)。雷公藤多苷片(免疫模型的陽性藥)為上海復(fù)旦復(fù)華有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號：150502，規(guī)格10 mg。人的使用劑量為0.02 g/(kg·d)；日本大耳白兔的使用劑量為4 mg/(kg·d)。

1.3 實驗菌株 大腸桿菌(E.coli，菌株編號：1.0090)購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所藥理研究室進(jìn)行傳代，-80℃冰箱保存。

1.4 實驗試劑 營養(yǎng)肉湯購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，用于配制細(xì)菌培養(yǎng)液；麥康凱瓊脂購自中國藥品生物制品檢定所，用于培養(yǎng)并計數(shù)膀胱穿刺液中的E.coli；用于制備大耳白兔的急性血清病免疫性腎炎模型的牛血清白蛋白(BSA)購自VETEC公司；兔循環(huán)系統(tǒng)免疫復(fù)合物(Circulating immune complexes，CIC)檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；動力法測定血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)試劑盒和酶法測定血肌酐(Creatinine，Cr)試劑盒購自北京萬泰德瑞診斷技術(shù)有限公司，全自動生化分析儀(TBA-40FR)購自日本東芝集團(tuán)。

1.5 大腸桿菌感染的腎炎模型制備及指標(biāo)檢測方法 參考文獻(xiàn)[5～7]，大鼠禁食水24 h后，每只大鼠腹腔注射10 mL/kg 3.5%水合氯醛麻醉。麻醉后動物仰臥固定手術(shù)臺上，腹部皮膚消毒，下腹正中切開長約2 cm，逐層切開腹壁進(jìn)入腹腔，暴露膀胱，用動脈夾夾閉陰莖，之后結(jié)扎陰莖。除假手術(shù)組同等條件下膀胱注射生理鹽水外，其余各組用1 mL注射器向膀胱內(nèi)緩慢注入0.75 mL濃度為1×108個/mL的E.coli菌液。然后清理腹腔，逐層縫合腹壁切口，2 h后拆去陰莖結(jié)扎線，6 h后恢復(fù)飲水和供食。手術(shù)后24 h，各給藥組開始給藥，10 mL/(kg·d)，連續(xù)給藥5天，假手術(shù)組和模型組同等條件下灌胃蒸餾水。

給藥5天后，無菌條件下抽取膀胱穿刺液0.1 mL，并把穿刺液接種于麥康凱培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄有無E.coli菌落生長，有生長記為陽性，并計算菌落數(shù)。

1.6 急性血清病腎炎模型的制備及CIC、Cr和BUN的測定參考文獻(xiàn)[8～9]，將BSA用無菌生理鹽水溶解，除正常組，其余各組以250 mg/kg(2 mL/kg)的劑量1次經(jīng)家兔耳緣靜脈注射。正常組，同等條件下，耳緣靜脈注射生理鹽水。完成造模后，分籠飼養(yǎng)。造模后的第2天灌胃給藥，給藥量5 mL/(kg·d)，正常組和模型組同等條件下灌胃蒸餾水。

造模后第10天從耳緣靜脈處取清晨空腹家兔血3 mL，靜置2 h，3 000 r/min，離心20 min，分離血清，于-70℃冰箱中保存。ELISA試劑盒檢測CIC含量。全自動生化分析儀測定血Cr和BUN含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。膀胱穿刺液的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)陽性率的組間比較采用χ2檢驗。CIC、Cr和BUN的測定結(jié)果的組間比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)用(±s)表示。2組間數(shù)據(jù)用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膀胱穿刺液細(xì)菌陽性率及菌落平均數(shù)量結(jié)果比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的膀胱穿刺液細(xì)菌陽性率及菌落平均數(shù)量均上升(P＜0.01)；與模型組比較，阿莫西林組、原方小劑量組和缺苦參小劑量組大鼠的膀胱穿刺液細(xì)菌陽性率及菌落平均數(shù)量下降(P＜0.05)；與阿莫西林組比較，缺苦參大劑量組大鼠的膀胱穿刺液細(xì)菌陽性率及菌落平均數(shù)量均升高(P＜0.01)。

表1 各組大鼠膀胱穿刺液細(xì)菌陽性率及菌落平均數(shù)量結(jié)果比較

2.2 各組日本大耳白兔CIC、Cr、BUN檢測結(jié)果比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組日本大耳白兔CIC顯著升高(P＜0.01)，BUN、Cr沒有差異；與模型組比較，雷公藤片組日本大耳白兔、原方大劑量組、原方小劑量組、缺苦參大劑量組、缺苦參小劑量組CIC顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，BUN、Cr沒有差異；與雷公藤片組比較，各組日本大耳白兔血清CIC、BUN、Cr均沒有差異。

表2 各組日本大耳白兔CIC、Cr、BUN檢測結(jié)果比較

3 討論

腎炎存在多種病因，以感染性和急性免疫性為主。而艾康組方在這2種不同病因的腎炎中起作用的方式可能存在差別[4，10]。有關(guān)中藥在腎炎中的組方研究已經(jīng)有較多的報道[9，11～12]。但是有關(guān)艾康組方在腎炎方面的研究則較少。本研究在大鼠和日本大耳白兔中成功地制備了上述2種腎炎模型，然后給予不同組方和劑量大小的艾康片，以觀察其對腎炎初步的干預(yù)效果。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)艾康片對由E.coli感染引起的腎炎動物模型效果較為明顯，對急性血清病腎炎動物模型血清中的CIC水平有明顯的降低作用。

在研究艾康片對由E.coli感染引起的腎炎有效性時，本研究首先觀察了培養(yǎng)的定性結(jié)果，即是否有E.coli在培養(yǎng)基上生長。在此基礎(chǔ)上，我們又分析了陽性培養(yǎng)結(jié)果中的E.coli菌落數(shù)在不同處理組之間的差別，結(jié)果進(jìn)一步說明小劑量組膀胱穿刺液中細(xì)菌數(shù)較少，大劑量組中的缺苦參大劑量組最多，由此初步證明小劑量組的療效更好。與復(fù)方蛇舌草沖劑和血尿安膠囊試驗中小劑量效果更好的研究結(jié)果基本一致[13～14]。

在采用艾康組方治療由BSA引起的急性血清病免疫性腎炎時，與模型組比較，CIC在血清中的含量在各用藥組中都有明顯降低。由于血清CIC能夠介導(dǎo)產(chǎn)生毛細(xì)血管內(nèi)增生性腎小球腎炎，其降低對于治療腎小球腎炎及預(yù)后意義重大[15]。BUN和Cr的變化不大可能原因是模型組和正常對照組之間差異不明顯造成的，也不能排除本研究存在模型不夠和給藥時間短等原因，為進(jìn)一步明確艾康組方對免疫性腎炎的有效性，在今后的實驗研究中應(yīng)增加動物模型以及延長給藥時間。

本研究成功構(gòu)建了E.coli感染引起的細(xì)菌性腎炎大鼠模型和BSA引起的急性血清病腎炎日本大耳白兔模型，在此基礎(chǔ)上通過進(jìn)一步驗證2種不同艾康組方及其劑量大小對腎炎的有效性，證明艾康組方對感染性腎炎效果較為明顯，對急性血清病腎炎的有效性在血清CIC水平得到體現(xiàn)。

綜合2個試驗，2種組方都有效，但原方更優(yōu)。方中苦參大苦大寒，其退熱泄降，蕩滌濕火之效，能殺濕熱所生之毒，較之黃芩、黃連力量益烈，具有抗病原微生物、利尿等作用[16]。野菊花、金銀花、薄荷疏風(fēng)清熱，以清肺衛(wèi)之熱毒；茯苓、蒼術(shù)健脾祛濕，以祛脾胃之濕滯。共奏清熱燥濕解毒之效。濕熱一去，則陽亦衰微矣。故大隊苦寒之中，少佐丁香、肉桂補(bǔ)火助陽以為反佐，防濕去陽微而功虧一簣，且少火亦可生氣，可保人之元陽不熄。黃芪、靈芝益氣扶正，固本培元。溫陽與益氣共用，可防止諸藥苦寒太過，傷人脾胃。川芎、木香活血行氣，通達(dá)氣血，使氣行血暢，壅滯之濕熱毒邪自可隨氣血而去。甘草甘平緩急，調(diào)和諸藥?？鄥⒌幕钚猿煞謴?fù)雜，苦參中苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、金雀花堿等毒性有確切報道[17]，臨床也有苦參應(yīng)用中毒的報道[18～19]，但是去除苦參后，療效有所降低，因此可對缺苦參方繼續(xù)進(jìn)行研究，找到更有效的用藥劑量和藥物配伍。