錢 平,羅 影,劉茹婷,唐旭東

(江蘇科技大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院,鎮(zhèn)江 212018)

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)發(fā)揮正常生物學(xué)功能的重要調(diào)節(jié)機(jī)制．其中,基團(tuán)類修飾的機(jī)制主要有甲基化、糖基化、磷酸化和乙酰化等;小分子修飾蛋白質(zhì)有泛素、類泛素(SUMO,NEDD8,ISG15,ATG8/12)等．修飾的底物蛋白涉及細(xì)胞內(nèi)生命活動的各個方面,如細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)降解和DNA損傷修復(fù)等[1]．神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白8(neuralprecursor cell expressed developmentally downregulated protein 8,NEDD8)是一種類泛素蛋白,它與底物蛋白的共價修飾過程稱為Neddylation[2],其發(fā)生過程與泛素化類似,都需要E1(NEDD8 E1 activating enzyme,NAE)、E2(UBC12和UBE2F)、E3(RING domain subunits RING-box protein 1,RBX1等)系列酶介導(dǎo)催化反應(yīng)并且這是一個可逆的過程[3-5]．研究者在肺腺癌、鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了Neddylation相關(guān)蛋白的過量表達(dá)[6-7],由此抑制Neddylation途徑成了抗腫瘤的一種策略．2009年，文獻(xiàn)[8]通過篩選藥物庫首次發(fā)現(xiàn)了Neddylation特異性的抑制劑MLN4924,MNL4924與NAE酶的競爭性結(jié)合阻斷它與E2的結(jié)合,從而阻斷了NEDD8與底物蛋白的結(jié)合，不僅能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡和自噬,還可以抑制腫瘤的血管發(fā)生細(xì)胞遷移[9-12]．MLN4924對肺癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴癌等都具有治療效果,目前作為唯一的Neddylation抑制抗腫瘤藥物，已經(jīng)進(jìn)入一期臨床實驗[9，13-15]．同時有研究發(fā)現(xiàn)MLN4924對許多病毒都具有抑制作用,如艾滋病病毒(HIV)、裂谷熱病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、腺病毒、流感病毒等…[16-19]．因此，MLN4924具有成為抗腫瘤和抗病毒藥物的潛在價值．前期研究發(fā)現(xiàn)，MLN4924對家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinuclear polyhedrosis virus,BmNPV)具有顯著的抑制效果.為了闡明其作用機(jī)理,文中從MLN4924對病毒宿主產(chǎn)生的影響角度開展研究,評估了MLN4924對家蠶BmN細(xì)胞的影響,旨在為MLN4924在家蠶研究領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)．

1 實驗

1.1 實驗材料

家蠶BmN細(xì)胞系由本研究室培養(yǎng)與保存,細(xì)胞培養(yǎng)條件為27 ℃,含有10% FBS、50 μg/mL氨芐青霉素和100 μg/mL鏈霉素的TC-100培養(yǎng)基，Applichem公司[20]；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；MLN4924，MCE公司；RNApure超純總RNA快速提取試劑盒，北京博凌科為生物科技有限公司；PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒，SYBR ? Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)試劑盒，TaKaRa公司(大連寶生物)．

1.2 細(xì)胞毒性測定

分別用1,5,10 μmol/L的MLN4924處理家蠶BmN細(xì)胞，二甲基亞礬(DMSO)處理組作為對照,持續(xù)處理時間點為24、48和72 h,隨后加入MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入Formanzan溶解液,最后用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光度．

1.3 細(xì)胞凋亡測定

用10 μmol/L的MLN4924處理家蠶BmN細(xì)胞,DMSO處理組作為對照,24 h后用PBS洗滌貼壁細(xì)胞3次,隨后依次加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液,5 μL Annexin V-FITC,10 μL碘化丙啶(PI)染色液,混勻后室溫孵育20 min,共聚焦顯微鏡拍照后統(tǒng)計視野中死亡細(xì)胞與正常細(xì)胞的比率,每個樣本統(tǒng)計3個視野．

1.4 MLN4924脅迫表達(dá)譜分析

用10 μmol/L的MLN4924處理家蠶BmN細(xì)胞,DMSO處理組作為對照,24 h后用試劑盒提取總RNA,委托華大基因公司完成測序工作,具體實驗和數(shù)據(jù)分析方法參照文獻(xiàn)[21]．

1.5 qRT-PCR

MLN4924細(xì)胞處理方式與1.4節(jié)一致,RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和定量PCR(qRT-PCR)按照各說明書進(jìn)行．選擇的差異蛋白基因分別為BGIBMGA000942、BGIBMGA007432、BGIBMGA008161、BGIBMGA013776、BGIBMGA005849、BGIBMGA012729、BGIBMGA007466,以GADPH為內(nèi)參基因,引物序列見表1．

表1 定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

qRT-PCR反應(yīng)在ABI7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行,應(yīng)用ABI 7300 SDS software V2.0(applied biosystems)軟件分析每個反應(yīng)的值,并計算相對表達(dá)量,用SPSS16.0(statistical program for social sciences 16.0)分析表達(dá)差異．

2 結(jié)果與分析

2.1 MLN4924對BmN的細(xì)胞毒性

用不同濃度的MLN4924處理BmN細(xì)胞24、48、72 h后,用MTT法檢測MLN4924對BmN細(xì)胞的毒性,結(jié)果如圖1.從圖中可看出，各個樣品在570 nm處的吸光值沒有顯著差異,表明實驗濃度的MLN4924對BmN細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性．

圖1 MLN4924對BmN細(xì)胞的毒性Fig.1 Celltoxicity of MLN4924 on BmN cells

2.2 MLN4924對細(xì)胞凋亡的影響

為了檢測MLN4924是否會引起B(yǎng)mN細(xì)胞凋亡,用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測用10 μmol/L MLN4924(M10)處理BmN細(xì)胞24 h

后的細(xì)胞凋亡情況.Annexin V-FITC可以透過壞死細(xì)胞的不完整細(xì)胞膜使細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光,PI可以透過染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期細(xì)胞的不完整細(xì)胞膜使細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色熒光,如圖2(圖中PI為碘化丙啶,死細(xì)胞核指示劑熒光圖;Light為白光下細(xì)胞形態(tài)圖;Overlay為熒光、細(xì)胞核指示劑和白光合并圖).由圖可看出，處理組和DMSO對照組都有一些細(xì)胞發(fā)生了凋亡；此外也統(tǒng)計了凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞的比率,結(jié)果表明MLN4924處理組和DMSO對照組凋亡細(xì)胞沒有明顯差異．

圖2 MLN4924對BmN細(xì)胞的細(xì)胞凋亡影響Fig.2 Apoptosis of BmN cells treated with NLN4924

2.3 MLN4924對家蠶細(xì)胞基因表達(dá)的影響

2.3.1 測序質(zhì)量分析

本研究所用測序樣品處理組(M10)和對照組(DMSO)分別獲得13 126 739和13 126 712條Raw Reads,經(jīng)過濾分別獲得12 875 504和12 917 892條Clean Reads,占比分別為98.08%和98.40%,各樣品Q20和Q30值都大于最小值,說明測序結(jié)果比較穩(wěn)定(表2)．

表2 RNA-seq數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Overview of RNA-seq data

測序飽和度分析的目的是檢驗檢測到的基因數(shù)目是否隨著測序量的增加而增加,分析結(jié)果表明，當(dāng)測序量達(dá)到60 M以上時,檢測到的目的基因數(shù)目逐漸趨于飽和(圖3),而本研究中兩組樣品的測序量都達(dá)到120 M以上,能夠達(dá)到對檢測的目的基因的完全覆蓋．

圖3 測序飽和度曲線Fig.3 Curve of sequencing saturation

這說明實驗獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量良好,可用于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析．

2.3.2 差異表達(dá)基因分析

家蠶數(shù)據(jù)庫中家蠶總基因14 623個，樣品中M10處理組和DMSO對照組分別檢測到10 972個和10 956個,占參考基因的75.03%和74.92%．在兩個樣品中都檢測到基因有10 265個,按照處理與對照基因表達(dá)水平超過2倍即認(rèn)為是差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn),有136個基因定義為差異表達(dá)基因,其中76個基因表達(dá)上調(diào),60個基因表達(dá)下調(diào)(圖4)．

圖4 差異表達(dá)基因統(tǒng)計分析Fig.4 Statistical analysis of DGEs

2.3.3 差異表達(dá)基因的功能

通過GO(gene ontology)基因功能分類系統(tǒng)對差異基因進(jìn)行注釋,發(fā)現(xiàn)其涉及31個GO分類條目, 15個條目屬于生物學(xué)過程,其中涉及細(xì)胞內(nèi)過程、代謝過程和單細(xì)胞過程的基因數(shù)目較多,分別為23,25和15個基因;10個條目屬于細(xì)胞內(nèi)組分,其中涉及細(xì)胞、細(xì)胞組分和細(xì)胞器組分的基因較多,分別為11、11和7個基因;6個條目屬于分子功能,其中涉及結(jié)合和催化活性的基因最多,分別有22和27個基因與此相關(guān)(圖5)．

圖5 差異表達(dá)基因的GO功能注釋Fig.5 GO functional classification of differential expressed genes

在KEGG(kyoto encyclopedia of gene genomes)數(shù)據(jù)庫中對差異表達(dá)基因可能涉及的信號通路進(jìn)行分析,以P值小于0.05作為富集標(biāo)準(zhǔn),獲得的136個差異基因中有87個可以富集到15個信號通路中,其中脂肪消化和吸收、溶酶體、胰腺分泌途徑有較多的基因富集(表3)．

表3 差異基因KEGG通路分析Table 3 KEGG pathway of DGEs

2.3.4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證

為了驗證高通量測序的有效性,隨機(jī)選擇7個基因?qū)ζ浔磉_(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測(圖6),所得結(jié)果與表達(dá)譜分析結(jié)果基本一致,雖然一些基因的表達(dá)差異倍數(shù)有一定差異,但基本的變化趨勢相同,這說明基因表達(dá)譜獲得的結(jié)果是可靠的．

圖6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證Fig.6 Validation of DGEs withqRT-PCR

3 結(jié)論

本研究中研究了MLN4924對家蠶BmN細(xì)胞的毒性和細(xì)胞凋亡的影響．通過查閱文獻(xiàn),在所有腫瘤細(xì)胞中有效抑制濃度均未超過10 μmol/L,因此選擇MLN4924的濃度為1～10 μmol/L．結(jié)果表明，在1～10 μmol/L的MLN4924脅迫下,與對照組相比,處理組BmN細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)顯著的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo),說明家蠶BmN細(xì)胞對MLN4924有較高的耐受性,該結(jié)果為以后在家蠶細(xì)胞中使用MNL4924提供了可靠的使用劑量標(biāo)準(zhǔn)．

目前已知的MNL4924抗腫瘤的機(jī)制主要為阻斷Cullin-RING泛素連接酶體中Cullin蛋白的Neddylation修飾,誘導(dǎo)Cullin-RING泛素連接酶底物的聚集,引起腫瘤細(xì)胞的DNA損傷、細(xì)胞周期劫持、凋亡或衰老[9; 22],但這不是MNL4924對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生作用的唯一途徑, Neddylation修飾的底物蛋白除了Cullin之外還有其他蛋白,如抗腫瘤蛋白P53,也是一個被Neddylation修飾的蛋白,MLN4924能夠通過RPL11/RPL5-Mdm2途徑激活P53的轉(zhuǎn)錄活性,從而達(dá)到抑制腫瘤的效果[23]．同時也有一些轉(zhuǎn)錄因子，如E2F1、TRIM40等， 會因為Neddylation修飾而形成轉(zhuǎn)錄活性的抑制,另外一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如mTOR、JNK、AKT、NF-κB等也受MLN4924處理的影響[10，24-26]．由此可見,MNL4924作為Neddylation抑制劑在蛋白翻譯后修飾和基因轉(zhuǎn)錄水平都影響了細(xì)胞的生理活動．本研究通過數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)研究了MNL4924對家蠶細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的影響,對所獲得結(jié)果綜合分析發(fā)現(xiàn),雖然所使用濃度的MLN4924沒有引起家蠶BmN細(xì)胞的明顯細(xì)胞病變,但確實對細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了影響,實驗中一共發(fā)現(xiàn)136個差異表達(dá)的基因,其中76個基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),60個基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)．GO和KEGG分析結(jié)果顯示這些基因參與了細(xì)胞的許多生物學(xué)進(jìn)程,如脂肪消化和吸收、溶酶體、類固醇代謝等．

前期實驗研究了家蠶NEDD8蛋白的基因序列、表達(dá)模式、細(xì)胞內(nèi)定位等信息[27],也發(fā)現(xiàn)MLN4924對BmNPV病毒DNA復(fù)制、多角體形成、出芽型病毒粒子形成具有顯著的抑制效果．將MLN4924表達(dá)譜數(shù)據(jù)與BmNPV感染表達(dá)譜數(shù)據(jù)交叉比對[28]發(fā)現(xiàn)，若干受BmNPV誘導(dǎo)表達(dá)的基因在MLN4924處理后出現(xiàn)了表達(dá)下調(diào)的情況,推測其可能與BmNPV復(fù)制有關(guān),但其具體機(jī)理還需要進(jìn)一步研究．