崔書建，王教瑜，姜 華，梁建生，*

(1．揚州大學生物科學與技術(shù)學院，江蘇揚州225009;2．浙江省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所，浙江杭州310021)

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)能夠在水稻生長過程中對其進行全面侵染，引發(fā)稻瘟?。?］。全球范圍內(nèi)各稻區(qū)均可發(fā)生稻瘟病，同時，全球約一半的人口以稻米為主食;因此，稻瘟病直接威脅全球糧食供應與糧食安全［1－5］。稻瘟病菌是研究真菌遺傳，以及植物與病原微生物相互作用的重要模式生物［6］。2005年，美國科學家完成了稻瘟病菌的全基因組測序，并公布其基因組草圖［2－4］，有力促進了對稻瘟病菌，及植物和稻瘟病菌互作分子機制的深入研究。

分泌蛋白是分泌到細胞膜外的蛋白質(zhì)，在動植物中均普遍存在，具有免疫反應、組織器官形態(tài)的維持信號傳遞等功能。在稻瘟病菌侵染植物的過程中，分泌蛋白也參與其中，并發(fā)揮重要作用。有研究顯示，稻瘟病菌附著胞特異表達的GAS1和GAS2基因均編碼分泌蛋白。這2個基因的缺失，不僅會降低稻瘟病菌附著胞的形成能力，而且還會降低稻瘟病菌的侵染力［7］。胞外幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CBP1研究顯示，該分泌蛋白起著信號傳導作用，幫助稻瘟病菌感知外界環(huán)境［8］。大量研究表明，寄主水稻與稻瘟病菌間存在特異性的識別關(guān)系，即“基因?qū)颉奔僬f。在水稻中，每一個顯性的抗性基因在稻瘟病菌中都存在一個與之對應的顯性的無毒基因［9］。照假說設(shè)定的互作體系，水稻抗病基因的產(chǎn)物會與稻瘟病菌無毒基因的產(chǎn)物相互識別，開啟水稻的防御反應，從而對稻瘟病菌產(chǎn)生抗性。水稻中有相應的抗病基因存在，同時稻瘟病菌中又有相應的無毒基因存在，水稻才可以表現(xiàn)出相應的抗病性［10］。根據(jù)無毒基因與抗性基因的“基因?qū)颉标P(guān)系，研究人員現(xiàn)已成功克隆出9個稻瘟病菌無毒基因［11］。這些無毒基因可以分為2類:品種特異抗性的無毒基因，寄主和非寄主特異性抗性的無毒基因。第一類無毒基因數(shù)量最多，主要包括Avr1-CO39、Avr-Pita、ACE1、AvrPiz-t、Avr-Pia、Avr-Pii和Avr-Pik/km/kp;第二類基因編碼 PWL激發(fā)子。PWL為一個基因家族，共計包含4個基因(PWL1、PWL2、PWL3 和 PWL4)，目前了解相應功能的是 PWL1 和 PWL2［12－13］。無毒基因的成功分離，不僅為“基因?qū)颉睂W說提供了支持，也為稻瘟菌致病性的研究提供了材料。無毒基因與寄主互作的特性決定了無毒基因多數(shù)為分泌蛋白，能夠從稻瘟病菌細胞分泌到寄主細胞內(nèi)。稻瘟病菌無毒基因與水稻抗性基因的“基因?qū)颉标P(guān)系，以及無毒基因大多數(shù)為分泌蛋白的事實，使得從分泌蛋白入手分離更多的效應子成為可能，為進一步探求互作的分子機理提供了手段。

分泌蛋白組一詞，在研究枯草桿菌分泌蛋白時首次提出［14］。含有信號肽的蛋白，并且能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑分泌，所有這些蛋白組的集合為分泌蛋白組。這些蛋白也被稱為經(jīng)典分泌蛋白［15］。本研究通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LCMS/MS)對稻瘟病菌的分泌蛋白組進行鑒定和研究，共鑒定出30個蛋白，經(jīng)過生物信息學分析驗證，其中，24個蛋白含N端信號肽，26個蛋白可分泌到胞外，3個蛋白定位在細胞膜上，只有1個定位在細胞質(zhì)內(nèi)。這些蛋白多為酶類，參與水解及能量代謝，研究結(jié)果可為進一步分離效應蛋白、揭示稻瘟病菌致病機理提供借鑒。

1 材料與方法

1．1 供試菌株

供試菌株Guy11為稻瘟病菌標準菌株，蒙浙江大學林福呈教授惠贈。

1．2 供試培養(yǎng)基

固體完全培養(yǎng)基(CM):將1 g酵母提取物、1 g酪蛋白氨基酸、10 g葡萄糖、2 g蛋白胨、3 g硝酸鹽、0.003 g維生素、0.01 g微量元素、15 g瓊脂粉，溶于1 L水中，滅菌。

稻谷粉培養(yǎng)基(固體):將20 g稻谷粉、1.5 g酵母提取物、15 g瓊脂溶于1 L水中，滅菌。

YEG培養(yǎng)基(液體):將2 g酵母提取物、10 g葡萄糖、3 g KNO3、2 g KH2PO4溶于 1 L水中，滅菌。

1．3 實驗方法

1．3.1 菌株活化

菌株活化參照Dioh等［16］的方法。將含有真菌菌株的濾紙片接種于稻谷粉培養(yǎng)基上，在12 h光照/黑暗交替條件下26℃進行活化。培養(yǎng)3 d后，取一小塊邊緣新鮮的菌絲接種于CM固體培養(yǎng)基上，同上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。3 d后，取1 mm含邊緣新鮮菌絲的菌落塊放入24孔板中，每孔加1.5 mL YEG液體培養(yǎng)基，黑暗條件下培養(yǎng)3 d。

1．3.2 稻瘟病菌分泌蛋白提取及定量

收集 YEG 培養(yǎng)液，12 000 r·min－1、4 ℃離心取上清，3 ku超濾柱去鹽富集濃縮，富集后的樣本基于二喹啉甲酸(BCA)比色法蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1．3.3 蛋白質(zhì)酶解

將 100 μg 蛋白加入 10 mmol·L－1二硫蘇糖醇(DTT)中，56 ℃溫浴 1 h，室溫下經(jīng) 50 mmol·L－1碘乙酰胺烷基化 45 min，加入 2 μg修飾級別的胰酶、50 mmol碳酸氫銨，pH大于8.0，37℃酶解過夜，0.1%三氟乙酸(TFA)終止酶反應;固相萃取小柱(Waters)去鹽，真空濃縮儀抽干，－80℃保存。

1．3.4 肽段在線分離及質(zhì)譜采集

肽段復合物經(jīng)20 μL 2%乙腈(CAN)/0.1%甲酸(FA)溶解，12 000 r·min－1離心10 min，吸取上清上樣，經(jīng)反相色譜柱(75 μm ×15cm，C18，Waters)在線分離。流動相A為2%CAN/0.1%FA，流動相B為98%CAN/0.1%FA。洗脫液流速設(shè)定為300 nL·min－1。液相色譜線性梯度洗脫程序如下:0—3 min，97%A，3%B;3—60 min，97% ～75%A，3% ～25%B;60—85 min，75% ～52%A，25% ～48%B;85—86 min，52% ～20%A，48% ～ 80%B;86—90 min，20%A，80%B;90—91 min，20% ～97%A，80% ～3%B;91—101 min，97%A，3%B。分離的肽段經(jīng)離子源離子化進入質(zhì)譜(TripleTOF 5600)采集，采集條件如下:離子源電場電壓2.3 kV，霧化氣為4，氣簾為35，加熱溫度150℃，圖譜采集模式為數(shù)據(jù)依賴型采集(DDA)模式。一級掃描參數(shù):質(zhì)荷比(m/z)350～1 300，累積時間0.25 s。串級掃描參數(shù):采集數(shù)目為25，m/z 100～1 500，累積時間0.1 s，動態(tài)排除時間25 s，碰撞能量波動狀態(tài)為激活狀態(tài)。

1．3.5 數(shù)據(jù)庫搜索及生物信息學預測分析

蛋白質(zhì)鑒定分析采用質(zhì)譜結(jié)果分析軟件Protein Pilot 4.5進行，數(shù)據(jù)庫下載于美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站，以“Magnaporthe oryzae”為關(guān)鍵詞條，共獲得55 916條蛋白序列，以多肽序列格式“fasta”下載，以實際抽取與匯報語言(perl)腳本檢測數(shù)據(jù)庫的完整性。數(shù)據(jù)庫檢索采用內(nèi)置算法(Paragon)進行，使用軟件自帶錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)分析，P值由軟件自動計算。具體參數(shù)(系統(tǒng)語言為英語，下文采用英語加中文注釋的方式)如下:Sample type(樣本類型)，Identification(鑒定);Cys alkylation(胱氨酸烷基化)，Iodoacetic acid(碘乙酸);Digestion(酶解)，Trypsin(胰酶);Instrument(儀器)，TripleTOF 5600;Results quality(結(jié)果質(zhì)控)，Detected protein threshold(檢測蛋白閾值)［Unsed ProtScore(conf)］＞0.05(10.0%)。取2個及以上肽段支持的蛋白，去除1個肽段支持的蛋白

鑒定到的蛋白經(jīng)信號肽預測工具SignalP v4.0分析，預測是否存在潛在的信號肽剪切位點及其位置，并通過蛋白質(zhì)亞細胞定位軟件Prot Comp 9.0進行亞細胞定位預測。

2 結(jié)果與分析

2．1 鑒定結(jié)果

通過Protein Pilot 4.5軟件分析，2次重復分別采集到58 409張及45 759張圖譜，鑒定到的圖譜分別是471張和387張，對應的肽段分別是286條和241條。篩選2個肽段及以上的蛋白，重復1鑒定到22個蛋白，重復2鑒定到25個蛋白，其中，重復的有17個蛋白，一共鑒定到30個蛋白(圖1)，具體見表1。

2．2 信號肽預測及定位結(jié)果

鑒定到的蛋白經(jīng)信號肽預測工具分析，根據(jù)預測標準，推測有24個蛋白含N端信號肽。進一步以軟件分析蛋白的亞細胞定位(表2):26個蛋白分泌到胞外，3個蛋白定位在細胞膜上，只有1個蛋白定位在細胞質(zhì)內(nèi)。

2．3 酶功能分類

圖1 鑒定結(jié)果Fig．1 Identified proteins from two independent replications

表1 蛋白鑒定詳細列表Table 1 List of proteins identified

對鑒定到的蛋白做進一步分析，去除假設(shè)蛋白，其中有11個蛋白是酶類，根據(jù)功能進行分類，主要集中在水解及能量代謝類別(表3)。其中，部分酶在降解植物細胞壁成分中起重要作用:阿魏酸酯酶B，可降解木質(zhì)素，木質(zhì)素是植物細胞壁的重要組成部分;糖苷轉(zhuǎn)移酶(3-1，3-葡聚糖酶)，可降解胼胝體，胼胝體是由β-1，3葡聚糖形成的多聚物，分布在植物的胞間連絲和韌皮部。

2．4 代謝途徑富集分析

KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因與基因組百科全書)是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫。功能信息存在通路數(shù)據(jù)庫中，包括碳水化合物、氨基酸、核苷等的代謝及有機物的降解。KEGG不僅提供代謝途徑，還全面注解催化酶。對分泌蛋白進行KEGG代謝途徑富集分析，可以找到顯著的通路，有助于理解稻瘟病菌入侵水稻時的生物學調(diào)控通路。富集結(jié)果顯示，鑒定到的蛋白在果糖和甘露糖代謝、過氧物酶體、糖酵解途徑、半乳糖代謝有富集(表4)。

2．5 蛋白互作分析

為了進一步挖掘分泌蛋白質(zhì)的信息，深入了解稻瘟病菌入侵水稻的分子機制，對鑒定到的蛋白進行相互作用分析是有必要的。STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db．org/)是一個基于已知和預測蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，這些相互作用包括蛋白質(zhì)直接的(物理上的)和非直接(功能性的)相關(guān)性。其數(shù)據(jù)主要來源于基因組背景數(shù)據(jù)、高通量的實驗數(shù)據(jù)、基因或者蛋白的共表達，以及前人研究知識。分析結(jié)果如圖2所示。在蛋白質(zhì)網(wǎng)絡分析中發(fā)現(xiàn)，MCG_09834與MCG_02625互作比較強，進一步分析發(fā)現(xiàn)，MCG_09834是過氧化物酶2，而MCG_02625是超氧化物歧化酶，超氧化物歧化酶能將自由基催化成過氧化氫(H2O2)，而過氧化物酶是以H2O2為電子受體催化底物氧化的酶，這兩者間存在相互作用，兩者的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜鑒定見圖3。

表2 蛋白質(zhì)生物信息分析結(jié)果Table 2 Bioinformatics analysis of proteins

表3 酶類分類表Table 3 Classification of identified enzymes

表4 KEGG代謝途徑富集分析結(jié)果Table 4 KEGG enrichment of proteins identified

3 討論

分泌蛋白多為病原微生物與植物受體蛋白起作用的激發(fā)子和其他致病因子，本研究通過LC-MS/MS鑒定稻瘟病菌的分泌蛋白質(zhì)組，并進行生物信息分析，提示酶在稻瘟病菌入侵過程中的作用，為進一步研究、揭示水稻與稻瘟病菌相互作用的分子機制奠定基礎(chǔ)。

圖3 酶結(jié)構(gòu)(左)與質(zhì)譜(右)Fig．3 Schematic diagrams of enzymes structures(left)and peptide fragments identified in mass spectrometer(right)

近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，LC-MS/MS逐漸成為蛋白組學的主要研究技術(shù)。高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)具備“三高”特性，即高自動化、高重現(xiàn)性和高分離效率，成為肽段分離的重要方法，結(jié)合質(zhì)譜，能夠形成高自動化的分離和鑒定系統(tǒng)［17－18］。在基于液質(zhì)聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學研究方法中，“鳥槍法”最為常用，即首先將蛋白質(zhì)混合物酶解，生成肽段混合物，再將肽段混合物進行色譜分離，在線用質(zhì)譜檢測洗脫的肽段［19］。本研究采用液質(zhì)聯(lián)用鑒定稻瘟病菌的分泌蛋白質(zhì)組，有30個蛋白被鑒定出，與直接鑒定稻瘟病菌蛋白差別很大(數(shù)據(jù)未展示)，暗示稻瘟菌在開始入侵時，可能僅分泌出少數(shù)蛋白來水解細胞壁，入侵成功后，再通過糖代謝提供能量，做進一步侵染，這可能是最有效的方式。

信號肽預測工具分析鑒定到的蛋白，推測有24個蛋白含N端信號肽。進一步分析亞細胞定位，26個蛋白分泌到胞外，3個蛋白定位在細胞膜上，只有1個定位在細胞質(zhì)內(nèi)。這些分泌蛋白可分為兩大類:一類是降解酶類，包括水解酶、酯酶、肽酶、氧化還原酶等，其中，部分酯酶和氧化還原酶同時參與能量代謝;另一類是結(jié)合蛋白，包括環(huán)管kelch蛋白、CIA30家族蛋白，這些蛋白幫助稻瘟病菌結(jié)合到細胞骨架和膜上。KEGG代謝途徑富集分析也驗證了酶類分類結(jié)果。這些蛋白在果糖和甘露糖代謝、過氧物酶體、糖酵解途徑、半乳糖代謝途徑有富集，而這些代謝途徑都與水解細胞壁、能量代謝相關(guān)。據(jù)此推測，稻瘟病菌分泌環(huán)管kelch蛋白，幫助稻瘟病菌結(jié)合到細胞壁上，分泌 1，3-β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶，并輔以肽酶及酯酶，使細胞壁變得松弛，阿魏酸酯酶B降解木質(zhì)素，從而降解水稻的纖維結(jié)構(gòu)。β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)移酶降解由β-1，3葡聚糖形成的多聚物(胼胝體)，再通過CIA30家族蛋白結(jié)合在膜上，在肽酶、酯酶等水解酶幫助下，稻瘟病菌進入細胞，達到最終侵入目的。