袁衛(wèi)東，陸 娜，宋吉玲，王偉科，亢學(xué)平，閆 靜，李戌清，*

(1．杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州310024;2．延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林龍井133400)

秀珍菇(Pleurotus geesteranus)，又名姬菇、小平菇，其營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，深受廣大消費(fèi)者喜愛，是浙江省重要的食用菌栽培品種之一。近年來，隨著秀珍菇栽培規(guī)模的不斷擴(kuò)大，栽培中出現(xiàn)的病害尤其是黃菇病造成的危害越來越嚴(yán)重。病害發(fā)生初期，局部現(xiàn)淡黃色斑點(diǎn)，病部黏濕;后期菇體腐爛，現(xiàn)黏稠狀分泌物，并伴有惡臭味。病害的發(fā)生不僅降低了子實(shí)體產(chǎn)量，而且嚴(yán)重影響品質(zhì)，給秀珍菇生產(chǎn)造成了巨大損失，嚴(yán)重影響了菇農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益和種菇積極性。

目前，已報(bào)道的食用菌斑點(diǎn)病大多是由假單胞桿菌引起的細(xì)菌性病害，如托拉斯假單胞桿菌(Pseudomonas tolaasii)引起的蘑菇褐斑?。?］，姜黃色假單胞菌(P．gingeri)引起的雙孢蘑菇黃斑?。?］，蘑菇假單胞菌(P．a(chǎn)garici)引起的菇姜黃色斑點(diǎn)?。?］，熒光假單胞菌(P．fluorescens)引起的平菇黃腐?。?］，布氏假單胞菌(P．brenneri)引起的香菇褐斑?。?］，惡臭假單胞菌(P．putida)和邊緣假單胞菌(P．marginalis)引起的杏鮑菇斑點(diǎn)?。?］等。為明確浙江秀珍菇黃菇病病原菌種類，為秀珍菇黃菇病的有效防控提供理論依據(jù)，筆者開展了病原菌的分離純化、致病性測(cè)定、質(zhì)譜鑒定、脂肪酸甲基酯(fatty acid methyl ester，F(xiàn)AME)鑒定及16S rRNA序列分析等系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1．1 材料

惡臭假單胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)seudomonas putida ATCC12633，來自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;秀珍菇菌株為臺(tái)秀57-FJLY，來自福建省羅源縣。

細(xì)菌分離純化采用NA培養(yǎng)基(配方:酵母粉1 g、牛肉膏 3 g、蛋白胨 5 g、蔗糖 10 g，加ddH2O補(bǔ)至1 000 mL，并調(diào)整pH至7.0)。菌落培養(yǎng)采用King's B培養(yǎng)基(配方:蛋白胨20 g、磷酸氫二鉀1.5 g、硫酸鎂1.5 g、甘油10 mL、瓊脂15 g，加ddH2O補(bǔ)至1 000 mL);MBT鑒定采用TSA培養(yǎng)基(配方:胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 15 g，加 ddH2O 補(bǔ)至 1 000 mL，并調(diào)整pH至7.3±0.2);FAME鑒定采用TSBA培養(yǎng)基(配方:胰蛋白胨大豆肉湯30 g、瓊脂15 g，加ddH2O補(bǔ)至1 000 mL)。

1．2 病原菌的分離與形態(tài)觀察

2016年底，從浙江省淳安縣發(fā)病的秀珍菇菇房?jī)?nèi)采集新發(fā)病的菇包，作為病害診斷和病原菌分離的樣品。在NA培養(yǎng)基上劃線分離培養(yǎng)，每個(gè)菇包劃2個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿上挑取1個(gè)單菌落純化，共獲得10個(gè)菌株。革蘭氏染色、菌落形態(tài)和部分細(xì)菌學(xué)特征測(cè)定參照Schaad等［7］的方法。

1．3 致病性鑒定

用39%棉籽殼、39%木屑、20%麩皮及2%石灰組成培養(yǎng)料，將含水量控制在60%左右，攪拌均勻后裝入18 cm×38 cm的聚乙烯塑料袋中，100℃常壓滅菌10 h。然后接入秀珍菇菌株(臺(tái)秀57-FJLY)，置于28℃人工氣候箱中培養(yǎng)。待菌絲長(zhǎng)至菇包口，形成菌膜即將出菇時(shí)，去除菌膜，用一次性注射器接入1.2節(jié)分離的各菌株懸浮液(濃度為3 ×108cfu·mL－1)10 mL，每菌株重復(fù)3個(gè)菇包。另取3個(gè)菇包接入10 mL無菌水作為對(duì)照。在28℃、相對(duì)濕度85%的人工氣候箱中繼續(xù)培養(yǎng)，從第3天開始每天觀察記錄病情發(fā)展情況，并從發(fā)病菇包中重新分離病原菌進(jìn)行驗(yàn)證，病原菌分離方法同1.2節(jié)。

1．4 MBT 鑒定

從1.3節(jié)鑒定的秀珍菇黃菇病菌中選取5個(gè)代表菌株進(jìn)行全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)(MALDI Biotyper，MBT)鑒定。各菌株在 TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，挑取單菌落加入含300 μL ddH20的1.5 mL EP管中，混勻后加入900 μL無水乙醇，混勻后 10 000 r·min－1離心 2 min，棄去上清液。加入50 μL 70%甲酸，混勻后再加入50 μL 乙腈，混勻后10 000 r·min－1離心 2 min，吸取上清液到另一干凈的1.5 mL EP管中。吸取1 μL上清液置于MALDI樣品靶上，放干后取1 μL基質(zhì)溶液用于測(cè)定。鑒定結(jié)果用FAV 3.0(flex analysis version)和MBV2.0 SR(MALDI BioTyper Version 2.0 SR 1)分析。將分析結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)(Biotyper)中儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)菌種的質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì)。

1．5 FAME 鑒定

FAME鑒定采用美國(guó)Agilent 6890N氣相色譜系統(tǒng)，參照 MIDI(microbial identification system)公司說明書進(jìn)行。純化的5個(gè)代表菌株在NA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)24 h，后轉(zhuǎn)入含有3%胰蛋白酶的TSBA培養(yǎng)基上再培養(yǎng)24 h。然后用直徑4 mm的無菌塑料接種環(huán)挑取一環(huán)培養(yǎng)菌放入干燥的有螺帽的試管底部，提取脂肪酸。鑒定結(jié)果通過MIDI Sherlock 6.0微生物鑒定系統(tǒng)軟件獲得。將分析結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)(TSBA6 6.00)中儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)菌種的脂肪酸信息進(jìn)行比對(duì)。

1．6 16S rRNA 序列測(cè)定

采用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物對(duì)27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')［8］和 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')［8］，對(duì)分離的秀珍菇黃菇病病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為:Redmix E 25 μL，27F 1.25 μL，1492R 1.25 μL，DNA 2 μL，加 ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR反應(yīng)在S1000 Thermal Cycler BIO-RAD型PCR儀上進(jìn)行，取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。獲得的序列利用Chromas編輯校正，用Clustal W程序進(jìn)行rDNA序列聯(lián)配比較，用DNAstar和Mega 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 病害癥狀

秀珍菇菇包發(fā)病時(shí)，菇包處于菌絲生長(zhǎng)階段，表現(xiàn)為袋口附近出現(xiàn)零星黃色水珠，水珠黏度不大。隨著病害向下擴(kuò)展(一般可擴(kuò)展至菇包的1/2左右)，黃色水珠黏度加大(圖1)。病害通常導(dǎo)致菌絲長(zhǎng)滿菇包的時(shí)間延長(zhǎng)7 d左右。發(fā)病菇包在菌絲長(zhǎng)滿，進(jìn)入出菇環(huán)節(jié)后，經(jīng)過消毒仍可長(zhǎng)出子實(shí)體;但隨著子實(shí)體的增大，菇體會(huì)出現(xiàn)大量黃色黏稠狀水珠，使菇體腐爛，并使與之相鄰的健康菇體發(fā)病。

2．2 病原菌的細(xì)菌學(xué)特征

5個(gè)菇包共分離純化出10個(gè)菌株，這些菌株革蘭氏染色反應(yīng)均呈陰性，菌體桿狀，具1～2根極生鞭毛，能游動(dòng)，好氧，不產(chǎn)生芽孢。在NA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)24 h，菌落半透明，淡黃色，表面略隆起，邊緣光滑，圓形。在King's B培養(yǎng)基上可產(chǎn)生熒光素。培養(yǎng)3 d后的培養(yǎng)基伴有明顯的腥臭味。

2．3 致病性

致病性測(cè)定結(jié)果表明，在接種后第5～6天，菇包開始發(fā)病，有少量不黏稠的黃色水珠產(chǎn)生，并伴有惡臭味。接種無菌水的對(duì)照菇包無明顯變化。從接種發(fā)病的菇包上可分離獲得與接種菌株相同的病原菌。

圖1 被污染的菌包樣品Fig．1 Polluted mushroom package samples

圖2 平板上培養(yǎng)的菌株形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果Fig．2 Characteristics of strains cultured on NA plate and gram staining reaction

2．4 MBT 鑒定

MBT鑒定結(jié)果通過Biotyper軟件進(jìn)行分析，最終結(jié)果為數(shù)據(jù)庫(kù)中與樣品最為匹配的幾個(gè)細(xì)菌種屬，并給出相應(yīng)的分?jǐn)?shù)。分?jǐn)?shù)介于2.300～3.000，能完全可靠地鑒定到種的水平;介于2.000～2.299，能可靠地鑒定到屬的水平或有可能鑒定到種的水平;介于1.700～1.999，有可能鑒定到屬的水平;介于0～1.699，表示沒有可信的鑒定結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)菌株的MBT鑒定結(jié)果與原鑒定完全一致，分值為2.083。5個(gè)秀珍菇黃菇病分離菌代表菌株的MBT鑒定結(jié)果顯示，它們均被鑒定為 P．putida，MBT分值在 2.003～2.115，接近或高于標(biāo)準(zhǔn)菌株，具有較高的可信度(表1)。

2．5 FAME 鑒定

FAME鑒定結(jié)果匹配程度遵循Buyer等［9］的原則:相似性系數(shù)＜0.2，結(jié)果不可用;相似性系數(shù)≥0.2，可鑒定到屬;相似性系數(shù)≥0.5，可鑒定到種。標(biāo)準(zhǔn)菌株的FAME鑒定結(jié)果與原鑒定完全一致，F(xiàn)AME相似性為0.623。5個(gè)代表菌株的FAME鑒定結(jié)果表明，他們均屬于 P．putida，F(xiàn)AME的相似性介于0.809～0.869，均高于標(biāo)準(zhǔn)菌株(表1)，且FAME鑒定結(jié)果與MBT鑒定結(jié)果完全一致。

2．6 16S rRNA 序列分析

分離獲得的5個(gè)黃菇病菌代表菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增均得到一條約1.5 kb條帶(圖3)。所得條帶經(jīng)序列測(cè)定后與GenBank中相近種進(jìn)行blast比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖4)顯示:5個(gè)代表菌株 ZJ-01、ZJ-02、ZJ-03、ZJ-04和 ZJ-05與 P．putida標(biāo)準(zhǔn)菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚在同一分支上，且與GenBank中已登錄的P．putida序列親緣關(guān)系最近，在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚在同一分支上。

表1 秀珍菇黃菇病病原的MBT和脂肪酸鑒定結(jié)果Table 1 MBT and FAME identity of the pathogens causing yellow rot disease in Pleurotus geesteranus

圖3 五個(gè)代表菌株16S rRNA電泳圖Fig．3 Electrophoresis of 16S rRNA region PCR products of 5 typical strains

3 討論

秀珍菇含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，具有滋補(bǔ)身體和安神除煩等功效，可降低腫瘤、高血壓和糖尿病等疾病的發(fā)生［10－12］。近年來，秀珍菇深受我國(guó)城鄉(xiāng)居民的喜愛，已成為明星菜［13］。由于高產(chǎn)高收，菇農(nóng)們種植秀珍菇的熱情空前高漲。然而，隨著種植的規(guī)?；?，秀珍菇黃菇病常有發(fā)生，且病害擴(kuò)展非常迅速，常使整個(gè)菇房甚至整個(gè)生產(chǎn)基地只菇不收，菇農(nóng)絕收［13－15］。因此，明確秀珍菇黃菇病的病原菌可為病害的有效防控提供理論依據(jù)。

本研究對(duì)采自淳安秀珍菇菇包的黃菇病病原菌進(jìn)行常規(guī)分離純化鑒定，并結(jié)合MBT鑒定、FAME鑒定和16S rRNA序列分析，明確了惡臭假單胞菌P．putida是引起浙江省秀珍菇黃菇病的病原菌。這與姚璐曄等［6］對(duì)江蘇昆山杏鮑菇生產(chǎn)工廠中染病菇的病原菌鑒定結(jié)果基本一致，其認(rèn)為惡臭假單胞菌P．putida和邊緣假單胞菌P．marginalis復(fù)合引起杏鮑菇斑點(diǎn)病;也與郭倩等［13］對(duì)引起華東及我國(guó)南方地區(qū)秀珍菇黃菇病病原菌的報(bào)道基本一致。

惡臭假單胞菌P．putida在自然界中存在極為廣泛［16］，尤其在水、空氣和土壤中最多，一旦環(huán)境條件適宜即可大量繁殖。如菇料滅菌不徹底、出菇期菌絲和菇料表面長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中、出菇期用水不安全等，均可使秀珍菇染病。此外，秀珍菇菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為23～27℃，子實(shí)體發(fā)生的適宜溫度為12～30℃，原基形成和分化成菇蕾的最適溫度為16～22℃，25℃以上菇蕾成熟加快［17］。而P．putida的生長(zhǎng)最適溫為30℃左右，在16～22℃生長(zhǎng)緩慢(試驗(yàn)數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。所以，在秀珍菇出菇階段，應(yīng)將菇房溫度控制在16～22℃，切不可為加快菇成熟速度，將菇房溫度升高至25℃及以上，否則易引起黃菇病暴發(fā)，導(dǎo)致絕產(chǎn)絕收。

圖4 基于16S rRNA的5個(gè)代表菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．4 Neighbor-joining tree constructed from the 16S rRNA sequences of 5 typical strains of Pseudomonas putida