陳 志，汪一婷，呂永平，牟豪杰，陳劍平，2，*

(1．浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江杭州310021;2．寧波大學(xué)植物病毒研究所，浙江寧波315211)

鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是傳統(tǒng)名貴保健品，野生資源一直處于供不應(yīng)求的狀態(tài)。隨著鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術(shù)和規(guī)?；N植技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的企業(yè)從事鐵皮石斛種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和人工種植，其栽培規(guī)模有了飛躍式的發(fā)展，全國鐵皮石斛種植面積達(dá)到約5 333 hm2，鮮條產(chǎn)量從2008年的1 200 t迅速增長到2014年的14 800 t，產(chǎn)值也從約3.9億元增長到約90.8億元。

20世紀(jì)80年代至今，有較多學(xué)者對(duì)鐵皮石斛的組織培養(yǎng)進(jìn)行了相關(guān)的研究和報(bào)道，如孫安慈等［1］最早進(jìn)行了鐵皮石斛組培苗生根誘導(dǎo)研究;葉秀粦等［2］對(duì)鐵皮石斛種子離體萌發(fā)進(jìn)行了報(bào)道;張治國等［3］篩選了鐵皮石斛原球莖分化培養(yǎng)基;饒寶蓉等［4］利用鐵皮石斛種子和莖段分別進(jìn)行組培研究后認(rèn)為，利用種子進(jìn)行無菌培養(yǎng)更有利于鐵皮石斛種苗工廠化生產(chǎn);羅紹強(qiáng)［5］以幼嫩莖段為起始材料進(jìn)行了鐵皮石斛組培快繁體系建立研究;徐玲等［6］研究了不同有機(jī)添加物對(duì)鐵皮石斛組培不同培養(yǎng)階段的影響，針對(duì)原球莖分化、生根階段篩選了不同的適宜有機(jī)添加物;彭文書等［7］利用響應(yīng)面法優(yōu)化了鐵皮石斛組培生根階段的培養(yǎng)基;常美花等［8］以帶芽莖段為起始材料，進(jìn)行了鐵皮石斛快繁技術(shù)體系研究;戴小英等［9］以鐵皮石斛種子及莖段為外植體進(jìn)行組培快繁體系建立研究，認(rèn)為以莖段建立體系優(yōu)于種子。但多數(shù)研究大多局限于某一階段，尚未形成系統(tǒng)、可靠的技術(shù)體系。

目前，多數(shù)鐵皮石斛生產(chǎn)主要以種子無菌播種培養(yǎng)為主，從種子播種到出苗培養(yǎng)周期過長，一般為12～14個(gè)月，種苗同步化較差。本研究結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際需求，以鐵皮石斛種子為起始材料，擬通過對(duì)其萌發(fā)成苗過程中的接種密度、有機(jī)添加物、光照環(huán)境等影響因素進(jìn)行研究，以期縮短種苗培養(yǎng)周期，提高種苗同步化率，服務(wù)于鐵皮石斛種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1．1 植物材料

雁蕩山鐵皮石斛成熟蒴果，由樂清鐵楓堂生物科技股份有限公司提供。

1．2 試驗(yàn)燈具

熒光燈(實(shí)驗(yàn)室):Philips，TLD 36W/840 cool white;LED白光:3 000 K。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3.1 種子準(zhǔn)備

在無菌工作臺(tái)上，將鐵皮石斛蒴果進(jìn)行表面消毒，然后切開3～5個(gè)蒴果，將種子混合倒入到一個(gè)無菌錐形瓶中，加入15～20 mL MS液體培養(yǎng)基，充分混勻后計(jì)數(shù)單位體積內(nèi)種子數(shù)量，為后期做準(zhǔn)備。

1．3.2 種子播種培養(yǎng)

以直徑為9 cm的培養(yǎng)皿為種子培養(yǎng)容器，前期利用M1～M4共4種培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)置2 000、5 000和10 000?！っ螅?3種不同接種密度進(jìn)行試驗(yàn)，后期利用M5～M21共17種培養(yǎng)基測(cè)試播種密度為8 000粒·皿－1的培養(yǎng)效果，M1～M21培養(yǎng)基成分見表1。培養(yǎng)環(huán)境分為光照時(shí)間 10 h，光照強(qiáng)度 25 ～ 30 μmol·m－2·s－1和全暗兩種環(huán)境，培養(yǎng)溫度(24±2)℃。

表1 種子萌發(fā)階段測(cè)試培養(yǎng)基Table 1 Medium for seed germination test of Dendrobium officinale

1．3.3 壯苗接種階段

壯苗接種階段主要考察不同接種密度、培養(yǎng)基和光質(zhì)對(duì)鐵皮石斛組培苗壯苗的影響，將萌發(fā)種子按照100、200和400株·瓶－13個(gè)接種密度進(jìn)行試驗(yàn)，接種培養(yǎng)基見表2，培養(yǎng)環(huán)境為光照時(shí)間 12 h，光照強(qiáng)度(40 ±2)μmol·m－2·s－1，光質(zhì)分別采用熒光燈和3 000 K色溫LED白光，培養(yǎng)溫度為(24±2)℃。

1．3.4 生根階段

生根階段主要考察LED白光在提高鐵皮石斛組培苗質(zhì)量方面的效果，以及對(duì)香蕉凍干粉代替香蕉應(yīng)用于鐵皮石斛組織培養(yǎng)的可行性進(jìn)行研究。將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗接種在M22培養(yǎng)基中，另一部分培養(yǎng)基利用剝皮香蕉80 g·L－1代替凍干香蕉粉。接種密度25株·瓶－1，光照時(shí)間 12 h，光照強(qiáng)度(40 ± 2)μmol·m－2·s－1，光質(zhì)分別為熒光燈和3 000 K 色溫 LED白光，培養(yǎng)溫度(24±2)℃。

實(shí)驗(yàn)材料培養(yǎng)3個(gè)月后，隨機(jī)挑選不同光環(huán)境及培養(yǎng)基處理10瓶，然后隨機(jī)分成3組，每組隨機(jī)挑選30株組培苗，測(cè)量其株高、莖粗。

1．4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算及圖表繪制，采用DPS 7.05進(jìn)行Duncan's多重比較(P=0.05)。

表2 鐵皮石斛壯苗階段培養(yǎng)基配方Table 2 Medium for seedling test of Dendrobium officinale

2 結(jié)果與分析

2．1 培養(yǎng)基及接種密度對(duì)鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響

據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，鐵皮石斛1個(gè)蒴果中包含種子平均數(shù)量為30 000粒左右，單粒種子大小約為0.1 mm(圖1-A)。在培養(yǎng)3個(gè)月后，萌發(fā)較好的原球莖呈多層次分布(圖1-B)，密度較大，難以對(duì)萌發(fā)苗數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

圖1 鐵皮石斛成熟種子及原球莖萌發(fā)Fig．1 Mature seed of Dendrobium officinale and seed germination

不同播種密度下，鐵皮石斛在M1～M4培養(yǎng)基中的萌發(fā)情況如圖2所示，結(jié)果表明，隨著接種密度的增大，鐵皮石斛種子萌發(fā)優(yōu)勢(shì)更明顯，在4種不同培養(yǎng)基中均表現(xiàn)出一致的趨勢(shì)。從不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)效果來看，隨著6-BA濃度的增加，種子萌發(fā)情況反而逐漸變差，尤其是M3和M4中，當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，種子萌發(fā)情況與培養(yǎng)基中6-BA濃度呈負(fù)相關(guān)。鑒于此，在隨后的實(shí)驗(yàn)中去除6-BA，重點(diǎn)考察NAA及有機(jī)添加物(凍干香蕉粉)濃度與種子萌發(fā)的關(guān)系，培養(yǎng)結(jié)果見圖3，圖3中培養(yǎng)皿表面M1對(duì)應(yīng)于表1中M5，其余依次類推。

圖2 鐵皮石斛種子不同培養(yǎng)基及培養(yǎng)密度的培養(yǎng)效果Fig．2 Effects of different medium and seed broadcasting density on Dendrobium officinale

本次試驗(yàn)鐵皮石斛種子起始接種密度為8 000?！っ螅?，在僅添加NAA的5種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的鐵皮石斛種子的萌發(fā)較差，而在單獨(dú)添加凍干香蕉粉及同時(shí)添加凍干香蕉粉和NAA的培養(yǎng)基中的鐵皮石斛種子萌發(fā)很好，而且種子萌發(fā)率也優(yōu)于基本培養(yǎng)基中接種密度為10 000?！っ螅?的處理。二次萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加凍干香蕉粉10～15 g·L－1配合NAA 0.2～0.5 mg·L－1，可有效促進(jìn)鐵皮石斛種子的萌發(fā)。

2．2 培養(yǎng)環(huán)境及接種密度對(duì)鐵皮石斛壯苗培養(yǎng)的影響

圖3 NAA和香蕉粉對(duì)鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響Fig．3 Effects of NAA and banana power on the germination of Dendrobium officinale

選擇圖3中M16(即表1中M20)培養(yǎng)基中的的萌發(fā)種苗進(jìn)行不同接種培養(yǎng)基及接種密度測(cè)試，因培養(yǎng)3個(gè)月時(shí)，原球莖仍較小，計(jì)數(shù)及接種均很困難，因此，試驗(yàn)在假定8 000粒種子全部萌發(fā)的前提下，將1個(gè)培養(yǎng)皿的全部原球莖混合均勻后，按一定比例接種在培養(yǎng)基中，作為本次接種密度測(cè)試的培養(yǎng)材料，試驗(yàn)方案參見1.3.3節(jié)。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基下鐵皮石斛組培苗均能正常生長，即不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛壯苗培養(yǎng)影響差異不明顯。對(duì)熒光燈與LED白光培養(yǎng)下的鐵皮石斛進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在LED燈下鐵皮石斛種苗較細(xì)，株高增長差異不明顯。

在壯苗過程中對(duì)組培苗株高影響較大的是接種密度，當(dāng)接種密度為100、200株·瓶－1時(shí)，組培苗株高及莖粗增長明顯;400株·瓶－1時(shí)，鐵皮石斛組培苗株高較低，基部仍有大量原球莖出現(xiàn)，可能原因是在壯苗繼代時(shí)植株表面附著大量肉眼不可見的未萌發(fā)種子繼續(xù)萌發(fā)，從而造成組培苗高度差異加大(圖4)。

2．3 光照環(huán)境對(duì)鐵皮石斛生根的影響

圖5表明，在3 000 K色溫LED白光下培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗株高顯著高于熒光燈下的培養(yǎng)材料，差異達(dá)到極顯著水平(圖5-A)，而莖粗差異不顯著(圖5-B)。

圖6分別為兩種光照環(huán)境下鐵皮石斛組培苗株高和莖粗在不同級(jí)別的數(shù)量分布比較。圖6-A中，3 000 K LED白光下培養(yǎng)材料的株高主要集中在5.0～7.9 cm，占樣品總量的84%，3個(gè)等級(jí)間組培苗的比例差別不大，均約28%，其他3個(gè)級(jí)別數(shù)量極少，占總樣本數(shù)的16%;熒光燈下培養(yǎng)材料的株高主要集中在5.0～5.9 cm，約占總樣本數(shù)55%，其余約占45%。圖6-B中，3 000 K白光LED下培養(yǎng)材料的莖粗主要集中在3.00～4.99 mm，約占樣品總量的80%，其中莖粗為3.00～3.99 mm的組培苗約占50%，4.00～4.99 mm的約占30%;熒光燈下培養(yǎng)材料的莖粗主要集中在3.00～4.99 mm，約占總樣本數(shù)的70%，其余比例約占30%。由此可見，LED白光下培養(yǎng)材料的株高的一致性優(yōu)于熒光燈下的培養(yǎng)材料。

圖4 接種密度對(duì)鐵皮石斛組培苗生長的影響Fig．4 Effects of culture density on the growth of Dendrobium officinale

圖5 光環(huán)境對(duì)鐵皮石斛組培苗生長的影響Fig．5 Effects of light on the growth of Dendrobium officinale

圖6 不同光環(huán)境對(duì)鐵皮石斛組培苗株高和莖粗分級(jí)情況Fig．6 Grading of Dendrobium officinale plantlets in height and stem diameter under different light condition

2．4 凍干香蕉粉在鐵皮石斛生根階段的測(cè)試

將鐵皮石斛組培苗接種在添加剝皮香蕉(CK)和凍干香蕉粉(T)的培養(yǎng)基并分別置于熒光燈(FL)及3 000 K色溫LED白光(LED)下進(jìn)行培養(yǎng)，其株高表現(xiàn)如圖7所示。結(jié)果表明，兩種不同光環(huán)境下培養(yǎng)結(jié)果均表明，在添加凍干香蕉粉和剝皮香蕉培養(yǎng)基中培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗株高無顯著差異。

圖7 不同添加物對(duì)鐵皮石斛組培苗株高情況Fig．7 Effect of different additives in medium on the height of Dendrobium officinale plantlets

圖8為兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)鐵皮石斛材料分別在3 000 K色溫LED光照環(huán)境及熒光燈培養(yǎng)3個(gè)月后的莖粗比較，結(jié)果表明，兩種不同光環(huán)境下培養(yǎng)結(jié)果均表明，兩種有機(jī)添加物中培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗莖粗無顯著差異。

圖8 不同添加物對(duì)鐵皮石斛組培苗莖粗情況Fig．8 Effect of different additives in medium on the stem diameter of Dendrobium officinale plantlets

3 討論

3．1 播種密度對(duì)鐵皮石斛種子組培萌發(fā)的影響

已有較多研究對(duì)鐵皮石斛組培技術(shù)及其影響因素進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道［4，10－11］，但關(guān)于播種密度對(duì)鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響尚未見報(bào)道。實(shí)際生產(chǎn)過程中，多數(shù)技術(shù)人員為了簡便，一般將1個(gè)蒴果內(nèi)的種子全部接種到1個(gè)培養(yǎng)瓶中，目前常用培養(yǎng)瓶內(nèi)徑約9 cm，按平均每個(gè)蒴果30 000粒種子計(jì)算，種子密度約高達(dá)470?！m－2，培養(yǎng)2～3個(gè)月后，培養(yǎng)瓶內(nèi)一般會(huì)堆積2～3 cm的厚原球莖，如此一來，上層原球莖因無法獲得充足養(yǎng)分而導(dǎo)致個(gè)體弱小，底層原球莖因光照較少，發(fā)育緩慢，從而導(dǎo)致整瓶原球莖發(fā)育程度和生理狀態(tài)差別很大，筆者認(rèn)為，這也是目前鐵皮石斛種苗生產(chǎn)企業(yè)最終種苗同步化率低的重要原因。

本研究對(duì)不同播種密度的鐵皮石斛種子進(jìn)行了萌發(fā)試驗(yàn)，結(jié)果顯示8 000粒·皿－1的接種密度更適合鐵皮石斛種子萌發(fā)培養(yǎng)，此時(shí)種子密度約為125粒·cm－2，在此播種密度下，萌發(fā)原球莖呈薄層均勻分布在培養(yǎng)基上，厚度不超過5 mm，原球莖萌發(fā)均勻，多數(shù)已長出2片子葉，萌發(fā)培養(yǎng)末期，幼苗高度基本達(dá)到7～10 mm。

3．2 凍干香蕉粉在鐵皮石斛組培中的應(yīng)用

植物組織培養(yǎng)一般都會(huì)在培養(yǎng)基中添加一些有機(jī)物促進(jìn)種苗生長，張治國等［3］利用20%的馬鈴薯、荸薺、香蕉提取物對(duì)鐵皮石斛原球莖分化影響進(jìn)行研究，表明馬鈴薯提取物的效果最好;蔣林等［12］研究結(jié)果認(rèn)為，香蕉汁和蘋果汁較馬鈴薯更能促進(jìn)鐵皮石斛試管苗根生成和生長;周江明［13］研究結(jié)果認(rèn)為，蘿卜提取液、水解酪蛋白、椰汁對(duì)鐵皮石斛組培苗生長具有有利的影響，其次為香蕉提取液、馬鈴薯提取液;劉世平［14］研究認(rèn)為，香蕉汁和土豆汁能夠顯著促進(jìn)鐵皮石斛叢生芽的增殖和壯苗生根;黃昌艷等［10］研究結(jié)果顯示，馬鈴薯對(duì)種子萌發(fā)增殖較香蕉好，而在生根階段，香蕉效果要優(yōu)于馬鈴薯;宋順等［15］報(bào)道，在生根壯苗培養(yǎng)基中添加香蕉泥有助于根的誘導(dǎo)和發(fā)育。由此可見，在鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程中有機(jī)添加物以土豆和香蕉為主，其中土豆用于原球莖分化方面效果較好，香蕉用于生根階段效果較好，通常使用量在8% ～12%。

本研究組培快繁技術(shù)路線為鐵皮石斛種子直接萌發(fā)成苗，省去了原球莖增殖、分化階段，因此僅采用凍干香蕉粉與香蕉作為有機(jī)添加物，探究其對(duì)鐵皮石斛的培養(yǎng)效果，結(jié)果顯示，凍干香蕉粉和香蕉中培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗在株高和莖粗方面差異不顯著。按照8%的使用量，培養(yǎng)基中使用剝皮香蕉成本約為0.8元·L－1，凍干香蕉粉為50 ～60 元·kg－1，當(dāng)使用量為 5 g·L－1時(shí)，使用成本約為0.3元·L－1，可降低部分組培苗生產(chǎn)成本。另外，在實(shí)際使用過程中，可能由于不同批次香蕉成熟度不一樣，會(huì)在一定程度上影響鐵皮石斛組培苗質(zhì)量，而利用凍干香蕉粉，由于同批次制備量大，可在最大程度上減少因香蕉成熟度不一樣導(dǎo)致的組培苗質(zhì)量差異。

3．3 LED白光在鐵皮石斛生根階段的應(yīng)用

LED應(yīng)用在鐵皮石斛組織培養(yǎng)方面也有較多報(bào)道，但多以不同紅藍(lán)比例LED混合光質(zhì)研究為主，如尚文倩等［16］研究顯示，紅藍(lán)光比例為1∶1時(shí)有利于鐵皮石斛試管苗的生長，且組培苗株高顯著優(yōu)于熒光燈下培養(yǎng)材料;楊維杰等［17］報(bào)道，在LED紅藍(lán)混合光1∶1環(huán)境下，鐵皮石斛種子萌發(fā)時(shí)間最短，相比對(duì)照可提前5～7 d;高亭亭等［18］研究表明，光質(zhì)對(duì)鐵皮石斛種苗和有效成分均有極顯著的影響，紅光有利于種苗根系與苗高生長，藍(lán)光有利于種苗增粗與生物堿積累，紅藍(lán)混光有利于葉綠素與多糖含量增加。上述研究報(bào)道尚未構(gòu)成完整的種苗生產(chǎn)系統(tǒng)，研究結(jié)果直接應(yīng)用在鐵皮石斛種苗生產(chǎn)上存在一定難度，而且在實(shí)際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，LED紅、藍(lán)光對(duì)人眼存在嚴(yán)重刺激，也在一定程度上限制了LED燈具的應(yīng)用。本研究首次采用3 000 K色溫LED白光，從其對(duì)鐵皮石斛組培苗的生長影響來看，可代替熒光燈用于鐵皮石斛組培苗照明。