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(南華大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，湖南 衡陽 421001)

喉癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全身腫瘤中占比1%～5%，在耳鼻咽喉頭頸外科的惡性腫瘤中位居第三，僅次于鼻咽癌[1-2]，喉癌發(fā)生主要源自喉部黏膜上皮細胞，喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)是喉癌最為常見的病理學類型[3]。目前關(guān)于喉癌發(fā)生、發(fā)展的病因和機制尚未完全闡明，以往的研究發(fā)現(xiàn)原癌基因被激活、抑癌基因被抑制、EB病毒感染、吸煙、環(huán)境污染等相關(guān)因素在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展中都有一定的影響[4-5]。EHD家族蛋白2(Eps15 homology domain containing 2, EHD2)是一種膜轉(zhuǎn)運調(diào)控蛋白，目前研究已發(fā)現(xiàn)EHD2在食管癌、乳腺癌、肝細胞癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中表達下調(diào)，其作為一種抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-9]。目前EHD2在喉癌中的研究在國內(nèi)外尚未見報道。本研究采用免疫組化法檢測EHD2在喉鱗狀細胞癌中的表達水平，并探討其臨床意義和Ki-67的關(guān)系，為將來喉癌的防治開拓新思路和提供新的潛在治療靶點。

1 資料與方法

1.1研究材料收集2012年1月～2016年6月期間南華大學附屬第一醫(yī)院的喉鱗癌患者的石蠟包埋標本50例，各患者均接受手術(shù)治療且有完整病理檔案資料；并收集同一醫(yī)院2017年1～12月期間手術(shù)切除的聲帶息肉標本50例。喉鱗癌患者女性2例，男性48例，年齡41～85歲(平均58.3歲)。聲帶息肉患者女性23例，男性27例，年齡29～69歲(平均48.8歲)。所有喉癌患者均由病理確診為喉鱗狀細胞癌，且臨床病史資料收集完整，所有患者在術(shù)前均未接受過放化療和其他特殊治療，在術(shù)后都完善了跟蹤隨訪，隨訪時間2～5年，其隨訪中位數(shù)2.3年(0.8年, 6.3年)，患者的生存時間以手術(shù)日期為起始點。在喉鱗癌中，聲門型25例，聲門上型15例，聲門下型10例；TNM分期(UICC2002)Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期18例；不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例；低分化13例，高中分化37例。

1.2方法喉鱗癌組織石蠟切片均由南華大學附屬第一醫(yī)院病理科提供。聲帶息肉組織組標本經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，送至南華大學病理教研室進行石蠟包埋、脫水，再連續(xù)切片(厚度約為 4 μm)。按SP試劑盒(北京中杉金橋公司)說明書執(zhí)行操作流程，石蠟組織切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鈉抗原修復液(0.01 mol/L)進行抗原修復，冷卻后PBS沖洗，3%過氧化氫液浴洗封閉內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗后滴加稀釋的EHD2和Ki-67抗體(1∶100，美國Proteintech公司)，孵育后PBS沖洗；滴加反應增強劑后孵育，PBS沖洗；滴加適量的增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，孵育后PBS沖洗；DBA顯色劑(北京中杉金橋公司)顯色，復染、分化、沖洗，脫水干燥、透明、封片，光學顯微鏡下觀察。采用雙盲法讀片，EHD2、Ki-67分別以細胞質(zhì)(或細胞膜)和細胞核中有棕黃色或棕黃色顆粒標志為陽性細胞。每張組織切片觀察5個高倍視野(200倍或400倍)，并都隨機計數(shù)200個腫瘤細胞。EHD2依據(jù)陽性細胞百分率和著色強度評分(0～3分)綜合評定。最終根據(jù)綜合評分定為兩個等級：≥2分為陽性、高表達，<2分為陰性、低表達[8]。Ki-67依據(jù)陽性細胞百分率將其分為四個等級(I～IV級)，并綜合評定：I級～II級評為陰性和低表達，III級～IV級評為陽性和高表達[2]。

1.3統(tǒng)計學處理本研究數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的處理和分析，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，EHD2、Ki-67間的表達關(guān)系分析用Spearman法檢測。5年總生存率用Kaplan-Meier方法進行分析并繪制生存曲線。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EHD2在喉鱗癌及聲帶息肉組織中的表達情況EHD2陽性表達主要被顯示在細胞膜和細胞質(zhì)中，呈棕黃色(圖1)。喉鱗癌組織50例中，陽性或強陽性17例，陽性率為34%(圖1B)，而對應的聲帶息肉組織50例中，陽性或強陽性34例，陽性率為68%(圖1A)。EHD2在喉鱗癌組織中的表達水平低于聲帶息肉組織(χ2=11.565,P=0.001)。而Ki-67的表達情況與EHD2相反(圖2)，Ki-67蛋白在喉鱗癌組織中陽性率62%(31/50)，在聲帶息肉組織中陽性率22%(11/50)，兩者差異有顯著性(χ2=16.420,P=0.001)。

2.2喉鱗癌組織中EHD2的表達與臨床相關(guān)參數(shù)的關(guān)系EHD2在38例不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗癌中，有16例陽性表達，而在12例有轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的喉鱗癌中，有1例陽性表達，表達率分別為42.1%(16/38)、8.3%(1/12)，無轉(zhuǎn)移組陽性表達率明顯較高，其差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.635,P=0.031)，表明喉鱗癌EHD2的表達水平與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在高中、低分化喉鱗癌組織中EHD2陽性表達率分別為43.2%(16/37)、7.7%(1/13)。隨著分化程度越低，陽性表達率越低(χ2=5.418，P=0.020)。EHD2的表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期均無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

2.3喉鱗癌組織中EHD2與Ki-67表達的關(guān)系采用Spearman法分析喉鱗癌組織中EHD2與Ki-67表達的相關(guān)性，結(jié)果顯示，兩種蛋白表達明顯呈負相關(guān)(r=-0.382，P<0.01)，見表2。

圖1 EHD2在喉鱗癌組織及聲帶息肉 組織中的表達(SP 200×)A：在聲帶息肉組織中陽性表達；B：在喉鱗癌組織中陽性表達； C：在聲帶息肉組織中陰性表達；D：在喉鱗癌組織中陰性表達

圖2 Ki-67在聲帶息肉組織和喉鱗癌 組織中的表達(SP 400×)A：在聲帶息肉組織中陰性表達；B：在喉鱗癌組織中陽性表達

2.4 EHD2表達水平和喉鱗癌預后的相關(guān)性50例喉鱗癌患者共完成隨訪45例(失訪率10%)，采用Kaplan-Meier方法進分析5年總生存率，結(jié)果顯示，EHD2陽性組患者的生存率為82.3%(14/17)，而陰性組為42.8%(12/28)，EHD2高表達組的患者生存率明顯高于低表達組(χ2=6.010，P=0.014)。其生存曲線見圖3。

表1 EHD2的表達與喉鱗癌臨床相關(guān)參數(shù)的關(guān)系

表2 EHD2和Ki-67在喉鱗癌中表達相關(guān)性

圖3 EHD2表達水平和喉鱗癌患者預后的相關(guān)性

3 討論

目前喉癌的治療主要采取以手術(shù)為主，放化療聯(lián)合的綜合治療方案[10]，但整體治療情況仍不容樂觀，且大多數(shù)患者術(shù)后聲音嘶啞、甚至失聲，生存質(zhì)量仍欠佳，目前尚無一種令人滿意的治療方案[3,5]。喉癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列演變過程，不是單一因素所致，是由一系列癌基因、抑癌基因及環(huán)境因素共同觸發(fā)而介導的復雜進程[11]。因此，尋找和探索新基因的功能對明確喉癌的發(fā)生發(fā)展機理有著重要意義。

胞吞作用可通過調(diào)控細胞的核信號、核轉(zhuǎn)錄和成瘤性從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。EHD2作為新發(fā)現(xiàn)的膜轉(zhuǎn)運蛋白，與EHD1、EHD3和EHD4共同組成EHD蛋白家族亞類[13]，在其C端包含EH域(Eps 15 homology domain)，由543個氨基酸殘基構(gòu)成，可通過連接不同的蛋白而發(fā)揮相應的作用，其主要功能是作為膜內(nèi)吞調(diào)控蛋白，參與調(diào)節(jié)吞噬作用[13-14]。它可調(diào)節(jié)多種人體組織中多類受體，從而調(diào)節(jié)各種生理過程，如調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架、小GTP酶和多種膜受體，從而使相應配體轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜[15-16]。EHD2在多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)存在異常表達，在食管鱗狀細胞癌中發(fā)現(xiàn)其高表達可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17-18]。在乳腺癌表達水平隨著其腫瘤病理學分級的升高而逐漸降低，與其不良預后密切相關(guān)[19]。

本研究采用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)EHD2可能與喉癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并分析EHD2表達情況與各臨床相關(guān)參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)EHD2表達水平與腫瘤組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，生存率分析發(fā)現(xiàn)EHD2高表達患者較低表達者生存率高。本研究EHD2與Ki-67在喉鱗癌組織中的表達呈負相關(guān)，EHD2可以穿梭至細胞核抑制轉(zhuǎn)錄，并且已有報道在前列腺癌中EHD2缺失可以促進腫瘤細胞的增殖，與本研究結(jié)果基本一致。提示EHD2是喉癌潛在抑制因子，但其具體機制尚需進一步實驗研究驗證。綜上所述，本研究EHD2在喉鱗癌及聲帶息肉組織中的表達具有差異性且與喉癌預后相關(guān)，提示其對于喉癌預后判斷有一定幫助，是喉癌治療的潛在治療靶點，但相關(guān)的分子機制仍有待進一步研究。