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(南華大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，湖南 衡陽 421001)

肝癌即肝細胞癌，是肝臟中最常見的腫瘤，發(fā)病率高，死亡率在各種惡性腫瘤中占第二位，對人類健康危害極大。microRNAs(miRNAs)是一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼RNA，通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)結合，導致其翻譯過程受到抑制或引起mRNA的降解，在轉錄后水平特異性影響靶基因表達[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs失調與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關[2-3]。MiR-193b的編碼基因位于人第16號染色體p13.12上，在非小細胞肺癌、食管鱗癌組織中呈低表達[4-5]。本課題組前期研究表明，miR-193b通過caspase-3途徑降低HepG2細胞對順鉑的耐藥性[6]，提示這種miRNA具有抗肝癌作用。然而，miR-193b在肝癌組織中的表達及與患者預后的關系仍不清楚。本研究采用熒光實時定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測miR-193b在肝癌組織及相應的癌旁非腫瘤組織中的表達，從而探討其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料40例原發(fā)性肝癌組織及相應的癌旁非腫瘤組織標本均為本院2008年1月～2011年12月手術切除后的經(jīng)石蠟塊保存的組織標本，并經(jīng)病理檢測確定，所有病例術前未行化療和放療，亦未合并其它系統(tǒng)惡性腫瘤。根據(jù)檔案室患者病歷資料，按年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、TNM分期情況及淋巴結轉移進行分類，并記錄5年內的生存情況。本實驗經(jīng)南華大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，同時征得患者或者其家屬的知情同意。

1.2主要試劑Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒、SYBR Green Real Time PCR Master Mix分別由美國Promega公司、上海生工生物工程公司、日本 Toyobo公司提供。

1.3熒光實時定量PCR(qRT-PCR) 采用Trizol試劑提取組織標本中的總RNA，并按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.22設計本實驗所使用的引物，并由華大基因生物科技有限公司合成，序列如下：miR-193b正義：5′-GTGCAGGGTC CGAGGT-3′，反義：5′-CTGTGCGTGTGACAG CGGCTGA-3′；以U6為內參， U6引物為：正義：5′-CTCG CTTCGGCAGCACA-3′，反義：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。在Roach480 qRT-PCR儀上進行PCR反應，反應條件：95℃預變性15 min，94℃變性15 s，55℃復性30 s，70℃延伸30 s，總共40個循環(huán)。利用ΔΔCt值法定量目的基因miR-193b表達水平。實驗過程中同時設置陰性、陽性對照。

1.4統(tǒng)計學分析通過SPSS14.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，兩組均數(shù)比較行t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，生存率分析利用Kaplan-Meier法，以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-193b在肝癌組織中的表達利用qRT-PCR檢測miR-193b在肝癌組織及相應的癌旁組織中的表達，其qRT-PCR的溶解曲線見圖1，從曲線上分析，各個標本的熔點基本上都集中在89℃左右，可以認為qRT-PCR的特異性較好，結果分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織miR-193b表達水平明顯低于癌旁組織，差異有顯著性(t=5.32,P<0.01)(圖2)。

圖1 miR-193b的qRT-PCR的溶解曲線

圖2 兩組miR-193b表達水平比較 與癌旁組織相比，*P<0.05

2.2 miR-193b表達與肝癌臨床病理特征分析為了進一步探討miR-193b與肝癌臨床病理特征之間的關系，以中位數(shù)為界值(1.68)將其分為miR-193b低表達組(≤中位數(shù))和miR-193b高表達組(>中位數(shù))，分別包括16、24個樣本。如表1所示，miR-193b表達與分化程度、TNM分期和淋巴結轉移相關(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤大小無相關性(P>0.05)。

表1 miR-193b表達與肝癌臨床病理特征的關系

續(xù)表

臨床參數(shù)nmiR-193b表達高(n=16)低(n=24)χ2PTNM分期 I+II18101526.53<0.05 III+IV2266淋巴結轉移 無1371621.46<0.05 有2795

2.3 miR-193b表達與肝癌患者生存的關系對40例肝癌患者術后生存狀況進行分析，相對于miR-193b低表達組，miR-193b高表達組患者5年生存率明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=25.38,P<0.05)，見圖3。

圖3 肝癌患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

肝癌是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，惡性程度高，預后差，其發(fā)生是一個多因素、多步驟的復雜過程，與乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染及黃曲霉素、酒精、亞硝胺類物質的長期攝入相關，但其發(fā)病機制仍未完全闡明。肝癌發(fā)病隱匿，許多患者確診時已到中、晚期，由于已發(fā)生局部腫瘤廣泛浸潤和/或遠處轉移而喪失了最佳的治療時機。近年來，盡管已采取包括手術、放化療在內的積極治療措施，5年生存率仍達不到預期水平，同時具有較高的復發(fā)傾向[7]。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機制并從中找出有效的分子標記物對于早期診斷、改善患者預后具有十分重要的意義。

隨著人類基因組計劃的完成，后基因組時代的來臨，包括miRNAs在內的非編碼RNA已成為生命科學最熱門的研究領域之一。作為一種多效性因子，miR-193b在細胞的增殖、分化、凋亡、自噬及血管生成等生物學過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，miR-193b在腫瘤形成和發(fā)展中具有多重功能，扮演著抑癌基因的角色。例如，Hulin，等[8]用miR-193b mimic處理乳腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)外源性給予miR-193b拮抗細胞遷移及新生血管形成。下調miR-193b表達則增加尿激酶型纖溶酶原激活物水平，進而促進乳腺癌細胞侵襲與轉移[9]。Zhang，等[10]報道，miR-193b在卵巢癌組織中表達下調，當其過表達時可顯著抑制卵巢癌細胞A2780增殖，并增加紫杉醇化療敏感性。在敲除頭頸鱗狀細胞癌FaDu細胞系的 miR-193b基因后，細胞的增殖、遷移、侵襲能力明顯提高[11]。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，miR-193b通過靶向沉默髓細胞白血病基因-1抑制肝癌細胞增殖，并誘導其凋亡[12]。本研究結果顯示，肝癌組織中miR-193b 表達水平較癌旁非腫瘤組織降低；miR-193b表達與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結轉移相關，但與年齡、性別、腫瘤大小無相關性；miR-193b高表達組患者5年生存率明顯高于miR-193b低表達組，這些結果表明miR-193b可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要作用，可作為評估腫瘤惡性程度及判斷預后的分子標記物，但具體作用機制仍有待進一步研究。隨著研究的深入，miR-193b可望成為肝癌防治的一個潛在的、有價值的靶點。