(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院新生兒科,江蘇 淮安 223300)

急性肺損傷是呼吸內(nèi)科常見病、多發(fā)病，其是由意外創(chuàng)傷、微生物感染、化學(xué)試劑等引起的，以進(jìn)行性呼吸困難、肺組織急性病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的肺部疾病[1]。研究表明急性肺損傷時(shí),體內(nèi)多種炎癥因子激活，進(jìn)一步加重肺部損傷[2]。目前關(guān)于急性肺損傷尚未發(fā)現(xiàn)有效治療手段，患者往往預(yù)后不良。干細(xì)胞具有較強(qiáng)的分化潛能，能修復(fù)多種組織損傷[3]，急性肺損傷時(shí)肺組織內(nèi)血管內(nèi)皮、肺泡壁組織、肺泡毛細(xì)血管屏障均遭到破壞，體內(nèi)白細(xì)胞介素6(interleukins-6，IL-6)、白細(xì)胞介素10(interleukins-10，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TGF-α)等炎癥因子水平顯著升高，促進(jìn)炎癥反應(yīng)、引起細(xì)胞程序性凋亡[4]。研究表明TRB3參與細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)[5]，且TRB3與急性肺損傷相關(guān)研究較少，本研究旨在探究研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對急性肺損傷大鼠的血清炎性因子及肺組織TRB3 mRNA表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 60只SD大鼠由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：scxk(湘)2014-0010，周齡4～6周，體重160～180g。將大鼠飼養(yǎng)在溫度21～25℃，濕度45～55%的空調(diào)房內(nèi)，保持12小時(shí)晝夜節(jié)律，并保持提供充足的水和食物。

1.1.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源于我院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科健康新生兒，產(chǎn)婦及家人均簽署之情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.3 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(hyclone)、胰酶(碧云天)、胎牛血清(Thermo Fisher公司，貨號：10099158)、脂多糖(LPS)(Solarbio公司貨號：L8880)、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素10、腫瘤壞死因子試劑盒(南京信帆生物技術(shù)有限公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒( 美國ThermoFisherScientific公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(Sigma-Aldrich)等。

1.1.4 主要儀器 SimpliAmpTMPCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)、低溫高速離心機(jī)(Hermel公司)、PCR Lightcycler 480 儀器(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)等。

1.2方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及疾病模型構(gòu)建[6]60只SD大鼠隨機(jī)分為以下3組(每組20只)：正常對照組，急性肺損傷模型組，干細(xì)胞治療組，飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，鼠尾消毒后急性肺損傷模型組和干細(xì)胞治療組鼠尾注射LPS(3 mg/kg)，正常對照組鼠尾注射同等體積生理鹽水，成模標(biāo)準(zhǔn)：12小時(shí)后，大鼠呼吸頻數(shù)增加，，出現(xiàn)呼吸窘迫，動脈血氧分壓/吸氧濃度<300mmHg即為造模成功。成模2小時(shí)后，C組予以氣管內(nèi)滴注人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液0.1 mL(細(xì)胞溶液濃度2×107個(gè)/mL)，正常對照組、急性肺損傷模型組予以同體積生理鹽水滴注。

1.2.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源于我院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科健康新生兒，產(chǎn)婦及家人均簽署之情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。胎兒臍帶去除動靜脈，PBS清洗后，手術(shù)剪剪碎臍帶至于15mL離心管內(nèi)，向管內(nèi)加入膠原酶3mL，靜至30min后，加入0.25%胰酶搖床上震蕩60 min加入培養(yǎng)基2 mL，去除肉眼可見大體積團(tuán)塊，用80目細(xì)胞篩過濾2次后，將濾液裝入另一15mL離心管，2500 r/min離心15分鐘，棄去上清液。將細(xì)胞懸液至于配置好培養(yǎng)基內(nèi)，擴(kuò)增至第5代后用于氣管內(nèi)滴注。

1.2.2 各組血清炎性因子水平測定 在造模成功并氣管滴注干細(xì)胞24小時(shí)后，抽取大鼠右側(cè)股靜脈血液2～5mL,將血液樣本標(biāo)記后靜置2 h，2000r/min離心10分鐘后，取上清液，置于-20℃待用。血清白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子(TGFα)水平采用ELISA法測定，操作步驟嚴(yán)格遵循測試盒說明書。

1.2.3 各組肺組織TRB3 mRNA表達(dá)量測定 在造模成功并氣管滴注干細(xì)胞24小時(shí)后，每組取3只大鼠，處死后取右肺上葉肺組織100mg， 用RNA試劑盒提取RNA后，將RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SybGreen I染料法測實(shí)時(shí)熒光定量PCR。TRB3上游引物、下游引物分別為：5′-TGATGCTGTCTGGATGACAA -3′，5′-GTGAATGGGGACTT TGGTCT -3′，內(nèi)參為GAPDH，上游引物、下游引物分別為：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′， 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，逆轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，測量計(jì)算與GAPDH 積分光比值，即為各組肺組織TRB3 mRNA表達(dá)量。

1.2.4 各組肺組織濕/干質(zhì)量比計(jì)算 在造模成功并氣管滴注干細(xì)胞24小時(shí)后，每組取3只大鼠，處死后取右肺上葉肺組織，生理鹽水小心快速沖洗后，濾紙輕柔擦拭表明殘余生理鹽水，稱量其質(zhì)量即為肺濕質(zhì)量(M)。其后將肺組織至于烤箱80℃烘干48 h，此時(shí)再次稱量其質(zhì)量即為肺干質(zhì)量(N)。肺組織濕/干質(zhì)量比= M/N。

2 結(jié)果

2.1三組炎癥血清炎性因子水平比較用藥24小時(shí)后，檢測3組股靜脈血清IL-6、IL-10、TGFα水平，急性肺損傷模型組血清IL-6水平為(329.47±13.28)ng/L較正常對照組(165.35±15.23)ng/L 顯著升高(t=40.335，P<0.01)，干細(xì)胞治療組血清IL-6為(256.67±12.44)ng/L顯著低于急性肺損傷模型組(329.47±13.28)ng/L(t=36.322，P<0.01)，說明人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可降低血清IL-6水平，見圖1。急性肺損傷模型組血清IL-10水平為(415.44±12.37)ng/L較正常對照組(142.55±13.25)ng/L 顯著升高(t=67.325，P<0.01)，干細(xì)胞治療組血清IL-10為(280.76±11.47)ng/L顯著低于急性肺損傷模型組(415.44±12.37)ng/L(t=35.704，P<0.01)，說明人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可降低血清IL-10水平，見圖2。急性肺損傷模型組血清TGF-α水平為(157.88±10.56)ng/L較正常對照組(27.56±8.33)ng/L 顯著升高(t=43.331，P<0.01)，干細(xì)胞治療組血清TGFα為(78.26±9.53)ng/L顯著低于急性肺損傷模型組(157.88±10.56)ng/L(t= 25.032，P<0.01)，說明人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可降低血清TGFα水平,見圖3。

圖1 三組血清IL-6水平比較**P< 0.01

圖2 三組血清IL-10水平比較**P< 0.01。

圖3 三組血清TGFα水平比較**P< 0.01

2.2三組肺組織TRB3 mRNA表達(dá)量比較急性肺損傷模型組肺組織TRB3 mRNA(2.343±0.154)較正常對照組肺組織TRB3 mRNA(0.632±0.013)顯著升高(t=49.511,P<0.01)。干細(xì)胞治療組肺組織TRB3 mRNA(1.071±0.065)顯著優(yōu)于急性肺損傷模型組肺組織TRB3 mRNA(2.343±0.154)(t=34.031,P<0.01)。詳見圖4。

圖4 各組TRB3 mRNA表達(dá)量比較結(jié)果**P< 0.01。

2.3各組肺組織濕/干質(zhì)量比比較研究結(jié)果顯示：急性肺損傷模型組肺組織濕/干質(zhì)量比(6.56±0.21)較正常對照組肺組織濕/干質(zhì)量比(3.38±0.12)顯著升高(t=58.798,P<0.01)。干細(xì)胞治療組肺組織濕/干質(zhì)量比(3.98±0.28)顯著優(yōu)于急性肺損傷模型組肺組織濕/干質(zhì)量比(6.56±0.21)(t=32.966,P<0.01)。詳見圖2由以上數(shù)據(jù)可知，急性肺損傷后，肺組織肺組織濕/干質(zhì)量比增加，干細(xì)胞治療后肺組織肺組織濕/干質(zhì)量比顯著降低，詳見圖5。

圖5 各組肺組織肺組織濕/干質(zhì)量比情況**P< 0.01。

3 討論

急性肺損傷是呼吸內(nèi)科常見病、多發(fā)病，其是由意外創(chuàng)傷、微生物感染、化學(xué)試劑等引起的，以進(jìn)行性呼吸困難、肺組織急性病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的肺部疾病[7]。研究表明急性肺損傷時(shí)體內(nèi)多種炎癥因子激活，進(jìn)一步加重肺部損傷[8]。目前關(guān)于急性肺損傷尚未發(fā)現(xiàn)有效治療手段，患者往往預(yù)后不良[9]。干細(xì)胞具有較強(qiáng)的分化潛能，能修復(fù)多種組織損傷，急性肺損傷時(shí)肺組織內(nèi)血管內(nèi)皮、肺泡壁組織、肺泡毛細(xì)血管屏障均遭到破壞，體內(nèi)白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素10、腫瘤壞死因子α等炎癥因子水平顯著升高，促進(jìn)炎癥反應(yīng)、引起細(xì)胞程序性凋亡[10]。研究表明TRB3參與細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)[11]，且TRB3與急性肺損傷相關(guān)研究較少，本研究旨在探究研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對急性肺損傷大鼠的血清炎性因子及肺組織TRB3 mRNA表達(dá)影響。為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性肺損傷研究提供參考依據(jù)。

Liu DD等[12]發(fā)現(xiàn)脂多糖在誘導(dǎo)急性肺損傷時(shí)，起作用的活性成分主要為內(nèi)毒素。內(nèi)毒素可引起肺部炎癥反應(yīng)，激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素10、腫瘤壞死因子α等炎癥因子，從而損傷肺泡上皮細(xì)胞，引起肺組織水腫，進(jìn)而影響患者通氣水平、血氧濃度導(dǎo)致呼吸衰竭[13]。因此可根據(jù)血清白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素10、腫瘤壞死因子α等炎癥因子水平判斷急性肺損傷嚴(yán)重程度及預(yù)后療效。

本實(shí)驗(yàn)表明在脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷24小時(shí)后，疾病組大鼠白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素10、腫瘤壞死因子α炎癥因子水平顯著升高，而人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植組大鼠血清白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素10、腫瘤壞死因子α炎癥因子水平較疾病組顯著下降，說明人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可緩解急性肺損傷炎癥水平。Wei K等[14]發(fā)現(xiàn)TRB3可由外部物理化學(xué)刺激誘導(dǎo)參與細(xì)胞凋亡，但具體涉及分子機(jī)制尚不清楚，可能與具體刺激原因及細(xì)胞類型有關(guān)。研究表明TRB3參與細(xì)胞多種生物代謝過程，其中包括細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，但目前TRB3與急性肺損傷研究較少[15]。本研究發(fā)現(xiàn)在疾病組大鼠肺組織中TRB3 mRNA表達(dá)顯著高于正常對照組，在進(jìn)行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植后，大鼠肺組織中TRB3 mRNA表達(dá)量明顯降低。且疾病組肺組織濕/干質(zhì)量比顯著升高，也表明其疾病組大鼠肺組織水腫嚴(yán)重，在進(jìn)行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植后肺組織濕/干質(zhì)量比明顯降低。

綜上所述，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可有效降低急性肺損傷大鼠的血清炎性因子及肺組織TRB3 mRNA表達(dá)水平，并減少肺組織濕/干質(zhì)量比。