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(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

我國糖尿病患病率急劇增加，已成為全球糖尿病人數(shù)最多的國家。糖尿病嚴(yán)重危害人類健康[1-2]，同時(shí)為國家和個(gè)人帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)鈣化是糖尿病的晚期并發(fā)癥[3]，是動(dòng)脈粥樣硬化疾病進(jìn)程中常見的不良事件，是心腦血管疾病致死致殘的重要預(yù)測因子[4]。因此研究斑塊內(nèi)鈣化的發(fā)生機(jī)制對糖尿病心血管并發(fā)癥的防治具有重要的理論價(jià)值及社會(huì)意義。已有的研究表明，基質(zhì)小泡(matrix vesicles，MV)是血管鈣化的起始位點(diǎn)[5]。MV通過膜聯(lián)蛋白及磷離子通道富集鈣磷離子，形成最初的羥基磷灰石結(jié)晶[6]。此后羥基磷灰石結(jié)晶作為鈣鹽結(jié)晶核心，繼續(xù)生長形成鈣化結(jié)節(jié)。但是在糖尿病斑塊內(nèi)鈣化患者中，MV與斑塊內(nèi)鈣鹽沉積的相關(guān)性如何，MV水平能否預(yù)測糖尿病患者的鈣化程度，現(xiàn)有的研究尚不能給出明確的答案。因此，本研究通過糖尿病足截肢患者脛前動(dòng)脈標(biāo)本的采集及分子生物學(xué)檢測，探討MV在斑塊內(nèi)鈣化中的作用，為糖尿病患者斑塊內(nèi)鈣化的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1研究對象選取2015 年10月～2018 年1月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院行糖尿病足截肢手術(shù)的患者共40例。根據(jù)組織鈣定量測定脛前動(dòng)脈鈣化程度將患者分為低鈣化組(鈣定量<4 mol/mg，n=20)及高鈣化組(鈣定量>4 mol/mg，n=20)。所有手術(shù)均經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書及手術(shù)同意書，醫(yī)務(wù)科備案。

1.2組織鈣定量測定使用0.6 mol/L HCl溶液對烘干的動(dòng)脈組織(約10 mg)進(jìn)行脫鈣24 h，收集上清液，使用鄰甲酚酞法測量鈣含量。

1.3 Vonkossa染色取脛前動(dòng)脈石蠟切片，脫蠟脫水后按試劑盒操作說明置于2% 硝酸銀溶液中，強(qiáng)陽光線下直射40 min 后用蒸餾水沖洗3 遍，吸凈蒸餾水后用5% 硫代硫酸鈉溶液定影處理2 min，再次用蒸餾水沖洗3 min，中性品紅復(fù)染3 min，經(jīng)脫水、透明、封片后，于光鏡下觀察主動(dòng)脈鈣鹽沉積情況。

1.4 MV的提取將組織從-80 ℃液氮中取出，裂解液充分裂解后放入無菌研磨器中冰上充分研磨，并靜置1 h。將混合液300 g室溫下離心5 min后20 000 g 4 ℃離心30 min去除組織碎片。收集上清液，并于超速離心機(jī)中100 000 g 4 ℃下離心60 min，PBS緩沖液洗滌沉淀物后同樣條件下再次離心60 min。MV沉淀用PBS緩沖液稀釋后放于-20 ℃保存。

1.5納米粒子跟蹤分析(NTA) 使用Zetaview(Particle Metrix)進(jìn)行MV濃度粒徑測試。其方法即納米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)，原理是對每個(gè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)行追蹤和分析，結(jié)合Stockes-Einstein方程式計(jì)算出納米顆粒的流體力學(xué)直徑和濃度。測量每個(gè)組的20個(gè)獨(dú)立樣本，然后顯示它們的平均值。

1.6掃描電鏡在獲得樣品的顯微照片之前，使用臨界點(diǎn)干燥器(PVT-3，Tousimis Semidri Rockville，MD，USA)從樣品中完全蒸發(fā)水。然后在真空下用10 nm金層涂覆樣品，并用SEM(SU8000和S4800，Hitachi，Tokyo，Japan)檢查。

1.7 Western blot檢測提取MV總蛋白，BCA 蛋白定量并煮沸變性，8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離后，電轉(zhuǎn)移(100 mA 2h) 至PVDF 膜上。5% 脫脂牛奶4 ℃搖床1 h后，用CD9抗體進(jìn)行免疫印跡。按1∶5 000比例加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1.5 h后，用Western blot 熒光檢測試劑激發(fā)熒光，蛋白條帶采用UVP凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，以各組目的蛋白與內(nèi)參蛋白吸光度值的比值來比較待測蛋白的表達(dá)差異。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料中正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；非正態(tài)分布中位數(shù)±四分位數(shù)間距。兩組間比較用t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率或百分比，組間比較用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)性分析，MV預(yù)測鈣化的敏感性與特異性采用受試者工作曲線(Receiver Operating Characteristic，ROC)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1糖尿病足截肢患者的基線資料低鈣化組和高鈣化組糖尿病足截肢患者在男女性別比例、平均年齡、吸煙史、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、高血壓比例、總膽固醇、空腹血糖(糖尿病患者強(qiáng)化胰島素治療后)、低密度脂蛋白(LDLC)及高密度脂蛋白(HDLC)等方面比較，差異無顯著性，而糖尿病病程存在顯著性差異。顯示糖尿病足截肢患者脛前動(dòng)脈鈣化程度可能隨患者糖尿病病程的增加而加重(表1)。

表1 兩組糖尿病足截肢患者的基線資料分析 (n=20)

2.2糖尿病足截肢患者脛前動(dòng)脈鈣化情況Vonkossa染色結(jié)果顯示兩組截肢患者脛前動(dòng)脈內(nèi)均可見大量的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，黑染的鈣化灶多分布在斑塊內(nèi)壞死核心灶周圍，尤其是斑塊靠近中膜的部位；且高鈣化組較低鈣化組的鈣化程度更重(圖1)。

圖1 兩組糖尿病足截肢患者脛前動(dòng)脈鈣化情況 Vonkossa染色顯示脛前動(dòng)脈斑塊內(nèi)鈣鹽沉積， 紅色箭頭所指棕黑色顆粒為鈣沉積區(qū).A：低鈣化組；B：高鈣化組

2.3糖尿病足截肢患者掃描電鏡下MVs特征掃描電子顯微鏡(SEM)結(jié)果顯示，低鈣化組(圖2A)中MV數(shù)量較少，而高鈣化組(圖2B)的MV數(shù)量多，且多呈富集狀態(tài)。

圖2 糖尿病足截肢患者掃描電鏡下MVs特征 檢測脛前動(dòng)脈斑塊內(nèi)MV， 圖中紅色箭頭所指區(qū)域?yàn)镸V富集區(qū).A：低鈣化組；B：高鈣化組

2.4糖尿病足截肢患者M(jìn)Vs標(biāo)記蛋白CD9表達(dá)水平Western blot結(jié)果顯示兩組提取物均表達(dá)MV標(biāo)記蛋白CD9，提示成功提取MV。并且相對吸光度值半定量分析顯示高鈣化組脛前動(dòng)脈斑塊內(nèi)CD9的表達(dá)量顯著高于低鈣化組，約高出2.62倍 (0.803±0.075vs0.307±0.122，P<0.01)。結(jié)合前述結(jié)果可推測，脛前動(dòng)脈斑塊內(nèi)的鈣化程度與MV的量有一定關(guān)聯(lián)。見圖3。

圖3 糖尿病足截肢患者M(jìn)Vs標(biāo)記蛋白CD9的表達(dá)A：Western blot檢測低鈣化組和高鈣化組MV中CD9的表達(dá)量；B：相對吸光度值半定量分析與低鈣化組比較，▲P<0.01

2.5糖尿病足截肢患者M(jìn)Vs水平與脛前動(dòng)脈鈣定量的相關(guān)性鈣定量測定顯示高鈣化組脛前動(dòng)脈斑塊內(nèi)鈣含量是低鈣化組的2.39倍(6.47±2.24 mol/mgvs2.71±0.96 mol/mg，表2)。Pearson相關(guān)性分析顯示，MV水平與脛前動(dòng)脈鈣含量成正相關(guān)(r=0.772 9，P<0.01；圖4)。

表2 糖尿病足截肢患者脛前動(dòng)脈鈣定量 及MVs水平(n=20)

圖4 MV水平與脛前動(dòng)脈鈣含量的相關(guān)性分析

2.6糖尿病足截肢患者M(jìn)Vs對脛前動(dòng)脈斑塊內(nèi)鈣化的預(yù)測價(jià)值ROC曲線顯示曲線下面積為0.894(95% CI：0.788～0.999，P<0.01)。MVs為41×106particles /mL時(shí)預(yù)測鈣化的敏感性為85%，特異性為85%，約登指數(shù)最大為0.7。見圖5。

圖5 糖尿病足截肢患者M(jìn)V對脛前動(dòng)脈斑塊內(nèi) 鈣化的預(yù)測價(jià)值

3 討論

糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的臨床終點(diǎn)事件包括不穩(wěn)定或穩(wěn)定的心絞痛、血栓形成、心臟病發(fā)作、中風(fēng)和冠狀動(dòng)脈猝死，斑塊內(nèi)鈣化的存在與上述臨床事件的發(fā)生密切相關(guān)[7]。冠心病的發(fā)病率已經(jīng)在不斷的上升,發(fā)病人群也逐漸從老年人群轉(zhuǎn)向中青年人群[8]。已有研究證實(shí)粥樣硬化斑塊內(nèi)鈣化是心血管事件的危險(xiǎn)標(biāo)志[7]，因此研究動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)鈣化對動(dòng)脈粥樣硬化疾病的預(yù)防和治療有重要的意義。

斑塊內(nèi)鈣化與骨發(fā)育過程類似，是一個(gè)細(xì)胞介導(dǎo)的高度調(diào)控并可逆轉(zhuǎn)的主動(dòng)過程[9-10]，是動(dòng)脈粥樣硬化疾病進(jìn)程中常見的不良事件，是心腦血管疾病致死致殘的重要預(yù)測因子[11]。斑塊內(nèi)鈣化是由于高鈣磷環(huán)境以及局部或全身礦化誘導(dǎo)子上調(diào)、抑制子下調(diào)所導(dǎo)致的骨特異性羥基磷灰石結(jié)晶主動(dòng)沉積在血管壁的病理過程[12]。在這一過程中, 血管壁礦化防御機(jī)制被耗竭, 平滑肌細(xì)胞等間葉細(xì)胞丟失原有表型而獲得成骨表型, 釋放礦化脂質(zhì)小泡。脂質(zhì)小泡(至少包括MV和凋亡小體兩種形式)為鈣化結(jié)晶提供了合適的成核微環(huán)境, 而血管壁彈性蛋白則為羥基磷灰石沉積提供了支架結(jié)構(gòu)[13]。凋亡過程中從巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞釋放的MV在形成鈣化過程中起關(guān)鍵作用。因此在成骨細(xì)胞樣細(xì)胞介導(dǎo)的鈣沉積與破骨細(xì)胞樣細(xì)胞介導(dǎo)的鈣吸收之間的平衡被打破后，血管壁內(nèi)膜、中膜或主動(dòng)脈瓣膜就可能形成異位鈣化[13-14]。本研究選取糖尿病足截肢患者脛前動(dòng)脈標(biāo)本，通過鈣定量檢測分組后進(jìn)行鈣化染色，直觀顯示了兩組標(biāo)本的鈣化程度。基線資料顯示鈣化程度可能與糖尿病病程有一定相關(guān)性。

MV是一種位于胞外，直徑50～200 nm的膜鑲嵌微顆粒。它是來自細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)，起源于礦物形成細(xì)胞(軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和牙質(zhì)細(xì)胞)的質(zhì)膜，選擇性分布于軟骨、骨等初始礦化位點(diǎn)[12,15]。MV被發(fā)現(xiàn)幾乎存在于所有正常的礦化或鈣化過程中，包括骨、軟骨、肌腱的鈣化。已有研究證實(shí)，血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等釋放的MV，是無定型磷酸鈣結(jié)晶成核的起始位點(diǎn)[16]。當(dāng)堿性磷酸酶調(diào)控的磷酸鹽濃度達(dá)到足夠成核濃度時(shí)，MV靠近膜的內(nèi)表面內(nèi)羥基磷灰石結(jié)晶形成并沉積于成骨膠原纖維中，通過釋放到細(xì)胞外基質(zhì)并與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的相互作用啟動(dòng)礦化過程，隨后繼續(xù)生長形成鈣化結(jié)節(jié)[16-18]。

已有的研究從不同側(cè)面闡述了糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)鈣化的成因及發(fā)展[19]，但在糖尿病斑塊內(nèi)鈣化的患者中，MV與斑塊內(nèi)鈣化的相關(guān)性如何，以及MV水平能否預(yù)測糖尿病患者的鈣化程度，現(xiàn)有的研究尚不能給出明確的答案。本研究提取糖尿病足截肢患者脛前動(dòng)脈內(nèi)MV，并以NTA法檢測MV水平[20]，Pearson相關(guān)性分析顯示，MV水平與脛前動(dòng)脈鈣定量正相關(guān)(r=0.7729，P<0.01)，ROC曲線顯示曲線下面積為0.894，提示MV水平用于預(yù)測脛前動(dòng)脈斑塊內(nèi)鈣化是有一定可靠性的。

本研究尚存在一定局限性。首先，本研究屬于觀察性研究，不能確定MV水平與斑塊內(nèi)鈣化的因果關(guān)系，后期還將從動(dòng)物水平及細(xì)胞水平做進(jìn)一步的研究。其此，MV的形態(tài)與MV內(nèi)成分對斑塊內(nèi)鈣化的形成也有一定影響，本研究由于條件限制未將上述因素納入分析，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將從以上方面進(jìn)行深入研究?？傊琈V水平與糖尿病動(dòng)脈斑塊內(nèi)鈣化的演進(jìn)存在正相關(guān),其水平對不同程度斑塊內(nèi)鈣化有一定的預(yù)測價(jià)值，這一結(jié)果可能為靶向發(fā)病機(jī)制的鈣化防治策略研究帶來新的切入點(diǎn)。