董 菁，胡孔興，劉 麗，陳佳峰

(1.蕪湖市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖市食品藥品稽查支隊(duì)，安徽 蕪湖 241000)

餐飲是人們賴以生存的基礎(chǔ)，隨著生活節(jié)奏的加快，工作壓力的增加，特別是互聯(lián)網(wǎng)銷(xiāo)售的突起，人們對(duì)于大眾化餐飲的需求每年都在呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，線上訂餐已經(jīng)成為一種流行.蕪湖市餐飲業(yè)更是借著這股春風(fēng)得以迅猛發(fā)展，而蕪湖市餐飲食品的投訴也在呈上升趨勢(shì).投訴內(nèi)容主要是餐飲的不潔加工導(dǎo)致的微生物超標(biāo).餐飲食品中的致病菌常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目為金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌檢測(cè).金黃色葡萄球菌(Staphylococous Aureus)系微球菌科，兼性厭氧菌，抵抗能力較強(qiáng)，分布較廣，廣泛存在于空氣、塵埃、水以及人和動(dòng)物的排泄物中,是引起食物中毒的常見(jiàn)致病菌之一，也是蕪湖市食品藥品檢驗(yàn)中心在餐飲食品檢測(cè)中檢出率最高的致病菌.

據(jù)美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，在美國(guó)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒數(shù)量?jī)H次于大腸埃希菌，居第 2位，占細(xì)菌性食物中毒的 33%，而在加拿大則占 45%[1-2].日本的調(diào)查結(jié)果表明，平均 32.5% 的食品存在金黃色葡萄球菌的污染[3-4].2010～2012年北京市共報(bào)告細(xì)菌性食物中毒27起，其中金黃色葡萄球菌食物中毒占22%[5-6].

食源性致病菌快速檢測(cè)方法主要有顯色培養(yǎng)基法、電阻抗法、微熱量法、免疫學(xué)方法及分子生物學(xué)檢測(cè)方法等[7-10].現(xiàn)有的金黃色葡萄球菌國(guó)標(biāo)的檢測(cè)方法為GB 4789.10-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》，該標(biāo)準(zhǔn)第一法中金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)從樣品增菌到最后確證鑒定需要5天時(shí)間，而且和其他食品相比，餐飲中含有大腸菌群、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌等其他微球菌干擾的情況更為突出，且微球菌屬在Baird-Parker平板上菌落形態(tài)及其相似，不宜區(qū)分，增加了檢測(cè)難度.

研究是為了解決現(xiàn)有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.10-2016檢測(cè)餐飲中金黃色葡萄球菌時(shí)間長(zhǎng)、干擾大、對(duì)檢驗(yàn)人員要求高等問(wèn)題，將培養(yǎng)基法和免疫學(xué)技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，建立了一種餐飲中金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)的方法.通過(guò)對(duì)2015～2017年蕪湖市餐飲食品中微生物檢驗(yàn)結(jié)果的分析，利用了金黃色葡萄球菌為需氧兼性厭氧菌以及其代謝產(chǎn)物中能產(chǎn)生血漿凝固酶的特點(diǎn)，將傳統(tǒng)的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)，縮短了餐飲食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)時(shí)間，減小了檢測(cè)難度.

1 材料與方法

1.1 樣品

市售餐飲樣品(主要為盒飯、涼拌菜、餐具).

1.2 培養(yǎng)基和試劑

7.5%氯化鈉增菌肉湯、無(wú)菌生理鹽水、Baird-Parker瓊脂平板、亞碲酸鉀卵黃增菌液、血瓊脂平板、凍干兔血漿(北京陸橋技術(shù)股份有限公司);VITEK 2 GP 鑒定卡(法國(guó)生物梅里埃公司);金黃色葡萄球菌選擇性平板.

金黃色葡萄球菌選擇性平板制備方法：自制(配方正在申請(qǐng)專利中).

無(wú)菌生理鹽水制備方法：稱取8.5 g氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min.

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌(ATCC6538);表皮葡萄球菌(ATCC12228);人葡萄球菌;大腸埃希氏菌(CMCC(B)44102);銅綠假單胞菌(ATCC9027);以上菌種均購(gòu)自廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心.

1.4 主要儀器和耗材

均質(zhì)器；恒溫培養(yǎng)箱；VITEK 2 COMPACT(全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng))儀；C-01 2.5L厭氧產(chǎn)氣袋(日本三菱瓦斯);C-43立式培養(yǎng)袋.

2 快速檢測(cè)法步驟

(1)增菌.稱取25 g樣品至盛有225 mL 7.5%氯化鈉肉湯的均質(zhì)袋中，8 000～10 000 r/min均質(zhì)1～2 min后，于36±1 ℃厭氧(將均質(zhì)袋放在立式培養(yǎng)袋中，并將一袋厭氧產(chǎn)氣袋放入，立即將封口封牢，即可達(dá)到厭氧效果)培養(yǎng)18～24 h.

(2)分離.將菌種增殖后的培養(yǎng)物，劃線接種到金黃色葡萄球菌選擇性平板上.36±1 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h.

(3)初步鑒定.金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌選擇性平板上呈圓形，表面光滑、凸起、菌落直徑為2～3 mm,顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色(非白色)的邊緣，周?chē)@以不透明圈(沉淀)，其外有一清晰透明帶.

(4)確證鑒定.挑取金黃色葡萄球菌選擇性平板上至少5個(gè)(不足5個(gè)全挑)可疑菌落接種到血平板上，于36±1 ℃培養(yǎng)18～24 h后，觀察是否溶血，選取溶血的菌落利用VITEK 2 COMPACT(全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng))儀進(jìn)行生化鑒定.

(5)報(bào)告.在25 g樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌.

3 自制金黃色葡萄球菌選擇性平板驗(yàn)證

將金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌分別挑取菌落0.5～1個(gè)溶于3 mL 0.45%的NaCl溶液中，配置成麥?zhǔn)蠞岫葹?.5～0.63(McF)的菌懸液,用接種環(huán)接種于Baird-Parker平板和自制的金黃色葡萄球菌選擇性平板上，36±1 ℃培養(yǎng)24～48 h.

4 結(jié)果和分析

4.1 結(jié)果

對(duì)抽取的餐飲樣品(盒飯50組，餐具50組、涼拌菜50組)利用GB 4789.10-2016和文中所提快速檢測(cè)法同時(shí)進(jìn)行金黃色葡萄球菌的定性檢驗(yàn)，兩種方法的檢驗(yàn)結(jié)果如表1所示 .

金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌在自制的金黃色葡萄球菌選擇性平板上的菌落形態(tài)分別如圖1和圖3所示.金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌在國(guó)標(biāo)法Baird-Parker平板上的菌落形態(tài)分別如圖2和圖4所示.金黃色葡萄球菌在血平板的菌落形態(tài)如圖5所示.金黃色葡萄球菌的生化鑒定結(jié)果如表2所示.

4.2 分析

通過(guò)對(duì)2015～2017年蕪湖市餐飲食品中微生物檢驗(yàn)結(jié)果的分析，利用了金黃色葡萄球菌為需氧兼性厭氧菌以及其代謝產(chǎn)物中能產(chǎn)生血漿凝固酶的特點(diǎn)，將傳統(tǒng)的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)，縮短了餐飲食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)時(shí)間，明顯減少了典型菌落數(shù)的挑取鑒定數(shù)量，且與國(guó)標(biāo)法吻合度達(dá)99.33%，對(duì)于150組中唯一不符合的一組盒飯進(jìn)行分析,結(jié)果如表1所示.由表1可知，在用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)該盒飯樣品時(shí)，該盒飯樣品含有大腸菌群、表皮葡萄球菌數(shù)量較多，對(duì)金黃色葡萄球菌可能產(chǎn)生了抑制作用，表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上的菌落形態(tài)極其相似，且表皮葡萄球菌在血平板上也能產(chǎn)生完全透明溶血圈，造成檢測(cè)難度，報(bào)告了一個(gè)假陰性的結(jié)果.

表1 國(guó)標(biāo)法和本法檢測(cè)情況對(duì)比

圖1 金黃色葡萄球菌在自制的金黃色葡萄球菌選擇性平板上的菌落形態(tài) 圖2 金黃色葡萄球菌在國(guó)標(biāo)法Baird-Parker平板上的菌落形態(tài)

圖3 表皮葡萄球菌在自制金黃色葡萄球菌選擇性平板上的菌落形態(tài) 圖4 表皮葡萄球菌在國(guó)標(biāo)法Baird-Parker平板上的菌落形態(tài)

圖5 金黃色葡萄球菌在血平板上的菌落形態(tài)

表2 VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)儀生化鑒定金黃色葡萄球菌陽(yáng)性結(jié)果

Biochemical Details2AMY-4PIPLC-5dXYL-8ADH1+9BGAL-11AGLU-13APPA-14CDEX-15AspA-16BGAR-17AMAN-19PHOS+20LeuA-23ProA-24BGURr-25AGAL-26PyrA+27BGUR+28AIaA-29TyrA-30dSOR-31URE-32POLYB+37dGAL+38dRIB-39ILATk+42LAC-44NAG+45dMAl-46BACI+47NOVO-50NC6.5+52dMAN+53dMNE+54MBdG-56PUL-57dRAF-58O129R+59SAL-60SAC+62dTRE+63ADH2s-64OPTO+

研究提供的方法在菌種增殖和分離時(shí)采用厭氧培養(yǎng)，有效阻止了餐飲中其他需氧菌(主要為大腸菌群)的生長(zhǎng)，在分離時(shí)采用的金黃色葡萄球菌選擇性平板對(duì)金黃色葡萄球菌有很好的選擇性.餐飲易污染的其他微球菌，如表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、中間葡萄球菌等在該平板上生長(zhǎng)情況較差，甚至不生長(zhǎng).將血平板的接種放在金黃色葡萄球菌選擇性平板接種之后進(jìn)行，對(duì)于不溶血的可疑菌落不用再做鑒定試驗(yàn)，減少了工作量并縮短了檢驗(yàn)周期.最終生化鑒定采用VITEK 2 COMPACT(全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng))儀，而不是國(guó)標(biāo)法的血漿凝固酶試驗(yàn)，又可以減去每半小時(shí)觀察凝固現(xiàn)象的繁瑣環(huán)節(jié)和結(jié)果不理想的重復(fù)試驗(yàn)次數(shù).

對(duì)典型菌落確認(rèn)時(shí)，快速檢測(cè)法只需對(duì)血平板上的典型菌落利用VITEK 2 COMPACT(全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)儀)進(jìn)行確認(rèn)，而國(guó)標(biāo)法(GB 4789.10-2016)需要對(duì)血平板和Baird-Parker平板上的典型菌落染色鏡檢，挑取鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性球菌的菌落接種到5 mL的BHI和營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18～24 h后，再進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn).在對(duì)150組餐飲樣品的檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于金黃色葡萄球菌檢出率最高的50組涼拌菜，國(guó)標(biāo)法用于鑒定的菌落數(shù)分別是：血平板上85個(gè)，Baird-Parker平板上105個(gè)；快速檢測(cè)法用于鑒定的菌落數(shù)僅是：血平板上33個(gè)；國(guó)標(biāo)法陽(yáng)性菌和用于鑒定的菌落數(shù)的比率(見(jiàn)表1)也明顯低于快速檢測(cè)法.這主要是因?yàn)椴惋嬍称废鄬?duì)其他食品而言，被大腸菌群和其他微球菌(表皮葡萄球菌、人葡萄球菌等) 同時(shí)污染的情況更為常見(jiàn)，典型菌落種類更多，所以利用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)餐飲食品中的金黃色葡萄球菌就會(huì)更繁瑣，并且工作量會(huì)成倍增長(zhǎng).

5 結(jié)論

與現(xiàn)有技術(shù)相比，研究利用了金黃色葡萄球菌為需氧兼性厭氧菌以及其代謝產(chǎn)物中能產(chǎn)生血漿凝固酶的特點(diǎn)，自制了選擇性和抗干擾性明顯優(yōu)于國(guó)標(biāo)法Baird-Parker平板的金黃色葡萄球菌選擇性平板，對(duì)于不溶血的可疑菌落不用再做鑒定試驗(yàn)，縮短了金黃色葡萄球菌的檢測(cè)時(shí)間，減小了檢測(cè)難度，提高了準(zhǔn)確性.