卞紫秀，汪建飛，王順民

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

苦蕎麥(Fagopyrum Tataricum)為雙子葉蓼科蕎麥屬植物，為“食藥兩用”的糧食珍品.苦蕎麥營養(yǎng)豐富，含有極為豐富的生物活性成分——黃酮類化合物.其萌發(fā)后黃酮類物質(zhì)尤其是蘆丁含量可成倍增加，營養(yǎng)價(jià)值和生物活性顯著提高[1].研究表明，磁場(chǎng)、電場(chǎng)和超聲波會(huì)對(duì)植物組織表現(xiàn)出一定的誘導(dǎo)效應(yīng)[2]，從而對(duì)萌發(fā)胚芽生長有調(diào)控作用[3-4].超聲波是一種頻率高于20 kHz的機(jī)械波，其具有的“空洞效應(yīng)”可有效刺激種子[5]，使植物種子產(chǎn)生一些特殊效應(yīng)，從而引發(fā)一系列生理生化變化[6]，促進(jìn)生長并縮短作物的成熟期[7-8].該特殊作用已引起了越來越多的谷物研究學(xué)者的關(guān)注[9].有研究表明，超聲波處理能有效激活植物種子萌發(fā)期的各種酶類的活性[10]，顯著提高種子萌發(fā)率及誘導(dǎo)種子中一些生物活性成分的合成[11-12].目前，有關(guān)超聲波預(yù)處理刺激谷物種子以富集黃酮類化合物的研究較少[11-12].超聲波作為一種安全高效的物理刺激手段來處理種子和植株幼苗目前已得到廣泛的應(yīng)用，但是過高強(qiáng)度的超聲波處理種子和幼苗可能會(huì)使細(xì)胞破裂，酶失活，而且不同農(nóng)作物對(duì)超聲波的感應(yīng)條件也不一樣.因此超聲波處理種子促進(jìn)萌發(fā)和富集活性物質(zhì)仍需進(jìn)一步研究.就不同超聲波處理對(duì)苦蕎麥種子的萌發(fā)及其萌發(fā)過程中黃酮類物質(zhì)含量的變化的影響，以及苦蕎麥萌發(fā)的最適超聲波處理?xiàng)l件做了探究，為苦蕎麥產(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

(1)試驗(yàn)材料及藥品.苦蕎麥(寧夏鹽池縣種子公司)；次氯酸鈉、高錳酸鉀、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

(2)試驗(yàn)器材.光照種子發(fā)芽箱(YRG-150，上海合恒儀器設(shè)備有限公司)；超聲波清洗機(jī)(JK-400CDB，合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)；冷凍離心機(jī)(TGL-16A，長沙平凡儀器儀表有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9023，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(UV-5800PC，上海元析儀器有限公司)；大容量離心機(jī)(L-550，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)苦蕎麥種子預(yù)處理.選擇顆粒飽滿、粒大的苦蕎麥種子，用清水沖洗干凈，以1.0 g/L高錳酸鉀溶液[7]浸泡消毒5～10 min，用清水洗滌至澄清.轉(zhuǎn)入25 ℃純凈水中浸泡4 h，期間換水一次.后將種子置于50 ℃～60 ℃溫水中催芽15 min.將種子(每組50粒)置于10 cm培養(yǎng)皿，進(jìn)行超聲波處理.

(2)超聲波處理.①預(yù)處理后的種子分別在功率為200 W、240 W、280 W、320 W、360 W和400 W，溫度為20 ℃下，超聲波處理30 min.②預(yù)處理后的種子在功率為280 W，溫度為20 ℃下，分別超聲波處理10 min、15 min、20 min、25 min、30 min和35 min.③預(yù)處理后的種子在功率為280 W，溫度分別為15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃，超聲波處理35 min.同時(shí)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)(CK為未經(jīng)超聲波處理種子).

(3)種子萌發(fā).將經(jīng)超聲波處理后的種子均勻平鋪在內(nèi)襯雙層濾紙的直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，于全自動(dòng)種子發(fā)芽箱中進(jìn)行避光培養(yǎng)，在25 ℃，濕度為75%～85%條件下培養(yǎng)7 d，每12 h淋澆一次水，一次澆水量為8 mL左右至第7 d結(jié)束.每12 h統(tǒng)計(jì)萌發(fā)種子數(shù)[8].取生長期為2 d和4 d的苦蕎麥芽苗稱重、研磨，后測(cè)定各指標(biāo).

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及測(cè)定方法

(1)萌發(fā)率.自開始培養(yǎng)起，每隔12 h，依次測(cè)量其萌發(fā)率(胚軸突破種皮1 mm即為萌發(fā))，連續(xù)測(cè)定7 d，每組重復(fù)3次，直至個(gè)別處理組萌發(fā)率達(dá)到100%.測(cè)定初始萌發(fā)率和最終萌發(fā)率[11].其中萌發(fā)12 h時(shí)萌發(fā)率為0.

(2)總黃酮.采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測(cè)定總黃酮含量.將一定量的蕎麥芽置于研缽中，加少量石英砂，以60%的乙醇進(jìn)行研磨、提取，提取液用冷凍離心機(jī)在9 000 r/min下離心15 min，取上清液進(jìn)行總黃酮測(cè)定(按干重計(jì))[11].通過繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，折算為黃酮含量.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=10.03x-0.002 9.R2為0.999.

(3)響應(yīng)面試驗(yàn).在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，考慮超聲波處理對(duì)萌發(fā)率和總黃酮含量的影響，研究采用Design-Expert 8.05軟件，以功率(A)、時(shí)間(B)和溫度(C)3個(gè)因素為自變量，以總黃酮含量(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以確定最佳方案.響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示.

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)其進(jìn)行One-way方差分析(ANOVA)，并用Duncan's復(fù)相關(guān)試驗(yàn)法進(jìn)行均值差異性的相關(guān)分析，顯著性水平p≤0.05.

2 結(jié)果及分析

2.1 超聲波處理對(duì)苦蕎麥種子萌發(fā)率及黃酮含量的影響

(1)超聲波功率對(duì)苦蕎麥種子萌發(fā)率的影響如圖1所示.從圖1可以看出，超聲波的功率會(huì)影響苦蕎麥種子的萌發(fā)率，低功率處理可以增加萌發(fā)率，高功率反之.其中萌發(fā)12～36 h時(shí)240 W功率處理下的種子萌發(fā)率最高，萌發(fā)48 h時(shí)，當(dāng)超聲波功率由160 W增加到400 W，萌發(fā)率隨功率增加而降低.萌發(fā)60～72 h時(shí)，在超聲波160～360 W功率處理下苦蕎種子的萌發(fā)趨勢(shì)平穩(wěn)，但當(dāng)萌發(fā)超過84 h時(shí)，萌發(fā)率隨超聲波功率增加而降低.超聲波的功率會(huì)影響苦蕎麥種子的萌發(fā)率，低功率處理可以促進(jìn)萌發(fā)而高功率會(huì)抑制萌發(fā).超聲波震蕩的作用在產(chǎn)生種殼碎片的同時(shí)促進(jìn)了水化過程，即提高了種子吸水率，又可有效改變酶分子結(jié)構(gòu)，促進(jìn)酶的催化作用達(dá)到加速種子萌發(fā)的效果[7-8].Yaldagard[7]等人發(fā)現(xiàn)用20%～90%的460 W超聲波功率處理大麥種子5～15 min，可使最終萌發(fā)率增加1.042～1.065倍，萌發(fā)期縮短30%～45%.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇280～360 W進(jìn)行后續(xù)研究.

(2)超聲波時(shí)間對(duì)苦蕎麥種子萌發(fā)率的影響如圖2所示.從圖2可以看出，超聲波處理時(shí)間的長短會(huì)影響苦蕎麥種子的萌發(fā)率.隨著處理時(shí)間的延長，萌發(fā)率呈增加趨勢(shì).短時(shí)間超聲波處理可以促進(jìn)萌發(fā)，但效果不明顯，處理35 min時(shí)萌發(fā)率明顯高于對(duì)照,故選擇處理時(shí)間為25～35 min進(jìn)行后續(xù)研究.由圖2還可以看出，超聲波時(shí)間會(huì)影響苦蕎麥種子的萌發(fā)率，隨著超聲波處理時(shí)間的延長，萌發(fā)率呈增加趨勢(shì)，短時(shí)間處理(低于15 min)促進(jìn)萌發(fā)效果不明顯.

圖1 超聲波功率對(duì)苦蕎麥種子萌發(fā)率的影響 圖2 超聲波時(shí)間對(duì)苦蕎麥種子萌發(fā)率的影響

(3)超聲波溫度對(duì)苦蕎麥種子萌發(fā)率的影響如圖3所示.從圖3可以看出，超聲波處理的溫度會(huì)影響苦蕎麥種子的萌發(fā)率，當(dāng)溫度由15 ℃升高到40 ℃，萌發(fā)率隨處理溫度的升高呈先減少后增加的趨勢(shì).低溫下處理對(duì)種子萌發(fā)的刺激作用不強(qiáng)，適當(dāng)升高溫度則有利于激活種子的相關(guān)酶的活性而促進(jìn)種子萌發(fā).萌發(fā)24～36 h時(shí)，萌發(fā)率隨超聲溫度增加先升高后降低，48 h時(shí)萌發(fā)率隨超聲溫度升高趨勢(shì)比較穩(wěn)定，但25 ℃時(shí)略有降低，而萌發(fā)60 h時(shí)，15 ℃～30 ℃下萌發(fā)率差異不顯著，溫度超過30 ℃后，萌發(fā)率增加，但是與對(duì)照差異不顯著.萌發(fā)72～84 h時(shí)，不同超聲溫度下萌發(fā)率趨勢(shì)穩(wěn)定.超聲波溫度均會(huì)影響苦蕎麥種子的萌發(fā)率.當(dāng)溫度由15 ℃升高到40 ℃，萌發(fā)率隨超聲處理溫度的升高呈先減少后增加的趨勢(shì).因?yàn)榈蜏叵绿幚韺?duì)種子萌發(fā)的刺激作用不強(qiáng)，適當(dāng)升高溫度則有利于激活種子的相關(guān)酶的活性從而促進(jìn)種子萌發(fā).故選擇溫度為20 ℃～35 ℃進(jìn)行研究.

(4)超聲波功率對(duì)苦蕎麥芽苗總黃酮含量的影響．不同超聲波功率下萌發(fā)2 d和4 d苦蕎麥中總黃酮含量如圖4所示.從圖4可知，隨著超聲波功率的增加，萌發(fā)2 d后的苦蕎麥芽苗中的總黃酮含量整體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，但都低于種子中黃酮的含量.功率為240～320 W時(shí)，總黃酮含量較高.功率為320 W時(shí)總黃酮含量達(dá)2.152±0.02 g/100 g.從圖4可知，萌發(fā)4 d后的苦蕎麥芽苗中的總黃酮含量呈先增加后降低的趨勢(shì).功率為280 W時(shí)，總黃酮含量最高，達(dá)4.76 g/100 g，分別比種子和CK增加64.98%和56.82%.適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚碛兄诜N子中黃酮類物質(zhì)的增加，但是功率過高則不利于黃酮類物質(zhì)的積累.原因?yàn)槌暡ㄌ幚砑せ盍伺c黃酮類物質(zhì)合成相關(guān)的酶[13]，導(dǎo)致含量顯著增加.故選擇280～320 W作為超聲波功率處理范圍.

圖3 超聲波溫度對(duì)苦蕎麥種子萌發(fā)的影響 圖4 不同超聲波功率下萌發(fā)2 d和4 d的苦蕎麥中總黃酮含量

(5)超聲時(shí)間對(duì)苦蕎麥芽苗總黃酮含量的影響.不同超聲時(shí)間下萌發(fā)2 d和4 d的苦蕎麥中總黃酮含量如圖5所示.從圖5可以看出，超聲波處理的時(shí)間顯著影響萌發(fā)后苦蕎芽苗中總黃酮含量.超聲時(shí)間為30 min時(shí)萌發(fā)4 d的苦蕎芽苗中總黃酮含量達(dá)4.770±0.02 g/100 g，分別比種子和CK增加65.40%和57.22%.一定超聲波功率下處理一定時(shí)間有助于種子中黃酮類物質(zhì)的增加，但是隨著時(shí)間的延長，其黃酮類物質(zhì)的含量增加不再顯著.植物生長過程中，種子中合成次生代謝物的相關(guān)酶的活性會(huì)在超聲波的刺激下，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長而提高，從而使黃酮含量隨萌發(fā)天數(shù)增加(由2 d增加4 d)而升高.故選擇25～35 min作為最佳的時(shí)間優(yōu)化范圍.

(6)超聲溫度對(duì)苦蕎麥芽苗總黃酮含量的影響.不同超聲溫度下萌發(fā)2 d和4 d的苦蕎麥中總黃酮含量如圖6所示.從圖6可以看出，超聲波處理溫度顯著影響苦蕎芽苗中總黃酮含量.當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，萌發(fā)4 d的芽苗中總黃酮含量達(dá)4.488±0.18 g/100 g，分別比種子和CK增加55.62%和47.92%.處理溫度升高處理有助于種子中黃酮類物質(zhì)的增加，但是溫度升高到一定范圍時(shí)，其黃酮類物質(zhì)的含量增加趨勢(shì)變緩，溫度過高則抑制了黃酮類物質(zhì)的合成.因?yàn)楹铣牲S酮類物質(zhì)的相關(guān)酶具有最適溫度，超聲溫度影響了其酶的最適溫度.故選擇20 ℃～35 ℃作為溫度的優(yōu)化范圍.

圖5 不同超聲時(shí)間下萌發(fā)2d和4d的苦蕎麥中總黃酮含量 圖6 不同超聲溫度下萌發(fā)2 d和4 d的苦蕎麥中總黃酮含量

2.2 苦蕎麥超聲波處理工藝優(yōu)化

(1)響應(yīng)面優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析.根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)CCD設(shè)計(jì)原理，響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示.由表2可知，其中1～12為析因試驗(yàn)，13～17為5個(gè)中心試驗(yàn)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差.萌發(fā)4 d的芽苗中黃酮含量較高且芽苗生長高度適宜，故以萌發(fā)4 d的芽苗中總黃酮物質(zhì)的含量為對(duì)象進(jìn)行工藝優(yōu)化.

表2 CCD響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及測(cè)定結(jié)果

超聲波處理的回歸分析如表3所示.由表3可知，該回歸方程模型顯著.模型的一次項(xiàng)超聲波功率(A)極其顯著，超聲波時(shí)間(B)和溫度(C)顯著.二次項(xiàng)超聲波時(shí)間*溫度(BC)顯著.模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.93，變異系數(shù)為3.56，說明該模型相關(guān)性較好，可用于對(duì)超聲波處理下苦蕎麥種子萌發(fā)工藝參數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè).響應(yīng)面分析結(jié)果如圖7、圖8、圖9所示.

表3 超聲波處理的回歸分析

(2)回歸方程及參數(shù)分析.采用Design-Expert 8.05對(duì)響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合并修正后，得到回歸方程：

Y(總黃酮含量)=-5.689 53-0.003 1A+0.340B+0.172C+0.003 6BC-0.006 1B2-0.005 8C2.

由圖7、圖8、圖9可知，苦蕎麥萌發(fā)過程中總黃酮含量隨微波功率增加而增加，但隨時(shí)間的延長先增加后降低.當(dāng)時(shí)間為30 min時(shí)，總黃酮含量達(dá)到峰值，然后隨時(shí)間延長而降低，且功率與時(shí)間有交互作用(p>0.05).由圖8可知，苦蕎麥萌發(fā)過程中總黃酮含量隨溫度的升高先增加后降低.當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，總黃酮含量達(dá)到峰值，然后隨溫度的升高而降低，且功率與溫度有交互作用(p>0.05).由圖9可知，苦蕎麥萌發(fā)過程中總黃酮含量均隨溫度和時(shí)間的升高，呈先增加后降低的趨勢(shì).當(dāng)溫度為30 ℃，時(shí)間為30 min時(shí)，總黃酮含量達(dá)到峰值，然后降低，且時(shí)間與溫度有交互作用，其作用顯著(p<0.05).

圖7 超聲波功率與時(shí)間交互時(shí)萌發(fā)4 d的苦蕎麥中總黃酮含量響應(yīng)面圖

圖8 超聲波功率與溫度交互時(shí)苦蕎麥萌發(fā)4 d中總黃酮量響應(yīng)面圖

圖9 超聲波時(shí)間與溫度交互時(shí)苦蕎麥萌發(fā)4 d中總黃酮含量響應(yīng)面圖

根據(jù)Design-Expert 8.05軟件對(duì)不同超聲波處理苦蕎麥種子的最佳工藝參數(shù)回歸方程擬合優(yōu)化后，得出超聲波處理苦蕎麥種子萌發(fā)的最佳工藝為超聲波功率316 W、時(shí)間29.26 min和溫度28.44 ℃.為便于實(shí)驗(yàn)，將最佳工藝優(yōu)化后取為超聲波功率320 W、時(shí)間30 min和溫度29 ℃.在此條件下萌發(fā)4 d的苦蕎麥種子中總黃酮含量較高，達(dá)8.24±0.32 g/100 g，比種子和對(duì)照增加1.857倍和0.478倍.研究中，超聲時(shí)間為30 min時(shí)萌發(fā)4 d的苦蕎芽苗中總黃酮含量分別比種子和CK增加65.40%和57.22%.超聲波處理有助于種子中黃酮類物質(zhì)的增加，但是功率過高則不利于黃酮類物質(zhì)的積累.適宜功率的超聲波處理一定時(shí)間有助于種子中黃酮類物質(zhì)的增加，但是隨著時(shí)間的延長，其黃酮類物質(zhì)的含量增加不再顯著.超聲處理溫度升高有助于種子中黃酮類物質(zhì)的增加，但溫度升高到一定程度時(shí)，其黃酮類物質(zhì)的含量增加趨勢(shì)則變緩，若溫度過高則抑制了黃酮類物質(zhì)的合成.溫度和功率均可影響植物萌發(fā)過程中SOD、過氧化物酶(Peroxidase,POD)和CAT活性相關(guān)酶的活性，從而影響其黃酮類物質(zhì)含量[14].有研究表明，超聲波處理可促進(jìn)小麥幼苗的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性提高而增加黃酮類物質(zhì)的含量[15].

3 結(jié)論

研究不同超聲波功率、時(shí)間以及溫度處理對(duì)種子萌發(fā)的影響，并對(duì)最佳處理?xiàng)l件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波處理苦蕎麥種子的最佳工藝為超聲波功率320 W，超聲波時(shí)間30 min，超聲波溫度29 ℃，在此條件下苦蕎麥種子萌發(fā)率較高，達(dá)98%.培養(yǎng)4 d后的芽苗中黃酮含量較高，為8.24±0.32 g/100 g.超聲波處理有助于提高苦蕎麥種子的萌發(fā)，有利于萌發(fā)過程中黃酮類物質(zhì)的富集.