周賢達(dá) 孫輝 丁康芬 王鳳辰 王浩波

摘 要： 為了解決田間西瓜葉片提取DNA雜質(zhì)較多及逐個(gè)樣品提取效率低的問(wèn)題，建立了基于96孔PCR擴(kuò)增板，每次提取96個(gè)樣，并調(diào)整提取液改善西瓜葉片DNA質(zhì)量?jī)?yōu)化的方法，經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，提取的DNA濃度為287～573 ng·?L-1，OD260/OD280在1.96左右，OD260/OD230為1.6～1.9，表明蛋白質(zhì)、酚類及小分子雜質(zhì)很少，DNA質(zhì)量較高；普通引物聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)表明DNA質(zhì)量穩(wěn)定、擴(kuò)增條帶清晰。此方法與目前常用的植物基因組DNA提取方法相比具有通量高、速度快、成本低的優(yōu)點(diǎn)，是適宜于種子企業(yè)西瓜分子標(biāo)記檢測(cè)相關(guān)工作的較好方法。

關(guān)鍵詞： 西瓜； DNA提?。?PCR

Abstract： In order to solve the problem of extracting more DNA impurities and low efficiency of single sample extraction in field watermelon leaves， a method based on 96-well PCR amplification plate to extract 96 samples at a time was established and the extract was adjusted to improve the DNA quality of watermelon leaves in this study. The concentration of DNA that extracted by spectrophotometer was 287-573 ng·μL-1， OD260/OD280 was around 1.96， and OD260/OD230 was 1.6-1.9， which indicated that there were few impurities in protein， phenols and small molecules， and the DNA quality was high. Polyacrylamide gel electrophoresis detection of common primers showed that the quality was stable and the amplified bands were clear. Compared with the commonly used plant genomic DNA extraction methods， this method had the advantages of high flux， high speed and low cost， it was a better method which was suitable for seed acid related molecular markers in seed enterprises.

Key words： Watermelon； DNA extraction； PCR

使用分子標(biāo)記手段可以大幅減輕田間育種和質(zhì)量檢測(cè)的工作強(qiáng)度，提高工作效率。隨著種子產(chǎn)業(yè)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，SSR等分子標(biāo)記手段已越來(lái)越普遍地應(yīng)用于種子室內(nèi)純度測(cè)定、品種真實(shí)性鑒定和分子標(biāo)記輔助育種等環(huán)節(jié)中[1-2]。SSR分子檢測(cè)的前提是高效提取符合質(zhì)量要求的DNA，而不同來(lái)源的材料對(duì)提取的DNA質(zhì)量有一定影響。正常的室內(nèi)純度檢測(cè)所需DNA一般取材于發(fā)芽后的下胚軸或芽尖，DNA質(zhì)量較高，但提取通量低、速度慢[3-6]。如果是對(duì)田間種植的西瓜品種進(jìn)行純度鑒定抽檢，則只能用葉片提取；當(dāng)開(kāi)展分子標(biāo)記輔助育種時(shí)，要保證有標(biāo)記的單株正常在田間生長(zhǎng)，由于室內(nèi)發(fā)芽提取DNA損壞了單株，顯然不適合采用該方法，也需要以田間生長(zhǎng)的葉片作為提取DNA的材料，而西瓜葉片提取的DNA往往含有大量的酚類物質(zhì)等雜質(zhì)[5-7]，達(dá)不到后續(xù)試驗(yàn)的質(zhì)量要求。另外，在實(shí)際商業(yè)化應(yīng)用中，逐個(gè)樣品提取DNA也不適應(yīng)規(guī)?；瘧?yīng)用分子標(biāo)記檢測(cè)。筆者的研究目的是在不影響DNA提取質(zhì)量的前提下，盡可能將DNA提取過(guò)程與后期PCR擴(kuò)增使用的96孔板配套起來(lái)，以提高工作效率；這種基于96孔PCR板的西瓜葉片DNA快速提取方法，在條件允許下也可以與移液工作站相配套，進(jìn)一步提高自動(dòng)化程度。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2018年7月19日從安徽省長(zhǎng)豐縣合肥豐樂(lè)種業(yè)西瓜試驗(yàn)基地的‘黑優(yōu)美西瓜品種上取樣，取樣標(biāo)準(zhǔn)為西瓜蔓頭部生長(zhǎng)2～3 d的幼嫩葉片，共采集96個(gè)單株。樣品使用1.5 mL離心管保存，取樣后當(dāng)天常溫下送至合肥豐樂(lè)種業(yè)國(guó)家企業(yè)技術(shù)中心分子實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃冰箱保存。

1.2 DNA提取

1.2.1 快速提取西瓜葉片DNA步驟 ①每片葉片取約0.5 cm×0.5 cm組織，按順序放入96孔板中，每片葉片放1孔；②將裝有葉片的96孔板底部浸泡在裝有液氮的泡沫盒中2 min，期間使用3 mm十字螺絲將葉片研磨成干粉；③每樣品孔加入提取液100 ?L（0.1 mol·L-1 Tris-HCL，pH 8.0；1.4 mol·L-1 NaCl；20 mmol·L-1 EDTA；2.5%（φ） SDS；1.5%（φ） PVP），迅速混勻，65 ℃水浴20 min，期間每10 min劇烈震蕩1次；④每孔加入苯酚︰氯仿︰異戊醇為25︰24︰1的混合液100 ?L，顛倒混勻至液體顏色變成均勻綠色，5 000 r·min-1離心6 min；⑤將上清液轉(zhuǎn)移至新96孔板，每孔加入冰凍無(wú)水乙醇100 ?L，輕輕倒置混勻，-20 ℃靜置10 min；5 000 r·min-1離心2 min，棄上清液；⑥用70%乙醇洗滌2次，室溫下倒置，干燥沉淀；加入50 ?L TE溶解沉淀，5 000 r·min-1離心3 min，取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆肹6-15]。

1.2.2 CTAB法西瓜葉片DNA提取步驟 參考《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》中提供的方法[3]。

1.3 DNA濃度及純度測(cè)定

使用Nano Drop 2000C（ThermoFisherScientific Inc.）測(cè)定OD230、OD260、OD280及DNA濃度。

1.4 SSR分子標(biāo)記檢測(cè)

1.4.1 供試SSR引物 選用《西瓜品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法》（NY/T 2472—2013）[16]中推薦的BVWS01734、BVWS00358兩對(duì)引物，由安徽通用生物技術(shù)公司合成。

1.4.2 SSR擴(kuò)增 參照周賢達(dá)等[12]的反應(yīng)體系，具體如下：10×PCR Buffer（含Mg2+）1 μL；2 mmol·μL-1 dNTP 0.9 μL；5 U·μL-1 Taq DNA聚合酶 0.1 μL；10 μmol·μL-1正向引物0.25 μL；10 μmol·μL-1負(fù)向引物0.25 μL；20 ng·μL-1模板DNA 2 μL；用ddH2O補(bǔ)齊至總體積10 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性15 sec，55 ℃退火15 sec，72 ℃延伸30 sec，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保溫。

1.4.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 使用4%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物：每10 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入2 μL 1×溴酚藍(lán)上樣緩沖液，穩(wěn)壓100 W電泳20 min，電泳結(jié)束后用硝酸銀染色觀察電泳條帶，拍照并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取時(shí)間比較

由DNA提取時(shí)間來(lái)看，使用西瓜葉片DNA快速提取法完成96個(gè)西瓜葉片的DNA提取每人共用時(shí)4 h，而使用CTAB法完成相同規(guī)模DNA提取則每人需要20 h [6]。

2.2 DNA質(zhì)量檢測(cè)

從表1可以看到，西瓜葉片DNA快速提取法提取的DNA濃度在287～573 ng·?L-1，相比CTAB法提取的DNA濃度是明顯低一些；OD260/OD280值在1.96左右，與CTAB的值2.0左右接近，說(shuō)明提取的DNA中的RNA含量小，基本沒(méi)有蛋白質(zhì)和酚污染；OD260/OD230值約1.6～1.9，與CTAB法提取的比值1.8～2.0也接近，說(shuō)明小分子污染很輕，不會(huì)對(duì)后續(xù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生不利影響；DNA產(chǎn)率在7.18～14.34 ng·mg-1，雖然明顯低于CTAB法的產(chǎn)率，但完全可以滿足室內(nèi)西瓜種子測(cè)純及后續(xù)分子試驗(yàn)的要求。

2.3 SSR擴(kuò)增檢測(cè)

從圖1和圖2對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，全部48個(gè)單株的帶型在2種DNA提取方法擴(kuò)增的BVWS01734引物擴(kuò)增的帶型除無(wú)擴(kuò)增單株外完全一致，西瓜葉片DNA快速提取法擴(kuò)增的結(jié)果相比CTAB法提取的條帶亮度稍顯暗淡，但主要帶型表現(xiàn)無(wú)差異。圖3和圖4對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，全部48個(gè)單株在BVWS00358引物擴(kuò)增帶型完全一致，2者條帶亮度也無(wú)明顯區(qū)別。

在與CTAB法提取的西瓜全基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果的比較中可以發(fā)現(xiàn)，2種方法之間在擴(kuò)增片段大小和非特異性擴(kuò)增上無(wú)區(qū)別，西瓜葉片DNA快速提取法完全可以滿足田間采集的西瓜葉片進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增的需求。

3 討 論

針對(duì)田間采集的西瓜葉片中酚類物質(zhì)極高，在葉片轉(zhuǎn)運(yùn)、保存過(guò)程中易由于細(xì)胞破裂導(dǎo)致酚類物質(zhì)污染，進(jìn)而導(dǎo)致后期DNA褐化而抑制PCR擴(kuò)增的情況，筆者使用PVP-40結(jié)合酚類物質(zhì)，后期經(jīng)離心去除；試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法提取的西瓜基因組DNA質(zhì)量與濃度均較高，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)要求，且與CTAB法相比，因?yàn)镻VP-40的加入，可以有效避免西瓜葉片在采集、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中因機(jī)械力作用導(dǎo)致細(xì)胞破碎進(jìn)而產(chǎn)生的酚類物質(zhì)污染問(wèn)題，明顯提高成熟西瓜葉片的DNA提取質(zhì)量[6-7，14]。

筆者充分利用96孔PCR板的通量高、普及化程度高的特點(diǎn)，將DNA提取與后續(xù)PCR擴(kuò)增步驟同步對(duì)應(yīng)，相較傳統(tǒng)方法可以節(jié)省3/4的時(shí)間，從而大大提高了整體檢測(cè)效率；而且由于整體過(guò)程在標(biāo)準(zhǔn)96孔PCR擴(kuò)增板內(nèi)進(jìn)行，也方便后期通過(guò)綜合運(yùn)用96孔組織勻漿機(jī)、自動(dòng)移液工作站繼續(xù)提高效率、擴(kuò)大規(guī)模，從而滿足種業(yè)公司西瓜室內(nèi)大規(guī)模檢測(cè)工作的要求。

從電泳圖中可以看到，使用西瓜葉片DNA快速提取方法提取的西瓜全基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物還是存在擴(kuò)增量較低的情況（圖1），在特殊情況下會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增失敗的情況，如圖1中的6號(hào)、8號(hào)10號(hào)及23號(hào)單株，這種情況的出現(xiàn)一方面與西瓜品種本身有一定關(guān)系，另一方面也與引物的擴(kuò)增能力有關(guān)，需要進(jìn)一步探討、研究。

在試驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)樣品研磨時(shí)間對(duì)提取效果有較大影響，操作人員的熟練程度直接決定了樣品研磨時(shí)間，并最終對(duì)提取質(zhì)量和DNA產(chǎn)率產(chǎn)生影響，因此熟練操作至關(guān)重要。

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