吳 志，龐 敏，陳 森，牛銀波，林冠杰

1.廣東省湛江市第四人民醫(yī)院(湛江524008)，2.西北工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院(西安710072)

主題詞 細(xì)胞增殖/病理生理學(xué) 成骨細(xì)胞 重樓皂苷I 骨保護(hù)素/代謝 @核因子-κB受體活化因子配體 大鼠

重樓又名“七葉一枝花”，為百合科植物，有消腫止痛、敗毒抗癌、鎮(zhèn)咳平喘、清熱定驚等作用,對(duì)癰腫跌打損傷、蛇蟲(chóng)咬傷、肺癆久咳、淋巴結(jié)核、骨髓炎等癥有良效。目前，研究者們主要對(duì)中藥重樓的抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行了較為集中的研究與闡明[1-2]。由于重樓是云南白藥的主要成分之一，在消腫止痛與治療跌打損傷方面有良效；其生物活性成分主要是甾體皂苷。因此筆者推測(cè)重樓皂苷(PPI I)可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損傷修復(fù)，并且具有防治骨質(zhì)疏松癥的潛能。本研究擬分離大鼠原代成骨細(xì)胞，通過(guò)觀察PPL I對(duì)其增殖作用的影響及相關(guān)機(jī)制，研究重樓皂苷防治骨質(zhì)疏松癥的作用。

材料與方法

1 材料與試劑 PPL I購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司，分子量為855.02，純度>98%。DMEM 培養(yǎng)液 (美國(guó)Hyclone 公司) ，胎牛血清 (美國(guó)Hyclone 公司) ，胰蛋白酶、EDTA、二甲基亞砜( DMSO) (美國(guó)Sigma 公司) ，CCK-8 Cell Counting Kit(南京諾唯贊生物科技有限公司)，ALP試劑盒 (南京建成生物公司) ，EdU 試劑盒 (廣州瑞博公司) ，OPG ，RANKL 與β-actin 抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。

2 大鼠原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)[3]以乙醚麻醉法將4只2～3日齡的新生SD大鼠(購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)處死后浸泡于75%酒精中5min，在無(wú)菌操作臺(tái)中取出其顱蓋骨，仔細(xì)刮除軟組織；將其浸泡在1∶4的胰酶/膠原酶液中40min，棄上清；使用眼科剪將骨塊剪為1mm3左右大小，接著加入I型膠原酶(0.1%，w/v)在37℃振蕩消化30min；加入與酶溶液等體積的含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，終止消化；吸取上清液，1000 r/ min 離心10min，去上清，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)30min后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶(差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞)。重復(fù)此過(guò)程，將細(xì)胞懸液接種于同一培養(yǎng)瓶。待細(xì)胞貼壁并鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部，用0.25 %胰蛋白酶消化，按1∶2 比例傳代。

3 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 在37℃、5% CO2的細(xì)胞孵箱中，使用加入10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)大鼠原代成骨細(xì)胞。以DMSO為溶劑將PPL I配置成為濃度為1 mol/L的儲(chǔ)藏液，放入4 ℃冰箱保存。使用前用培養(yǎng)液將儲(chǔ)藏液稀釋成工作濃度。成骨細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組及給藥處理組 (細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)設(shè)置3、10、30、100 μmol/L 4 個(gè)濃度; 其他實(shí)驗(yàn)選擇3、10、30μmol/L 3 個(gè)濃度)。

4 細(xì)胞增殖率的檢測(cè) 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的大鼠原代細(xì)胞，行胰酶消化后，將細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為2×103/孔，培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)12 h，充分貼壁后隨機(jī)分組。對(duì)照組細(xì)胞，僅加入含0.54‰ DMSO的200 μl培養(yǎng)液，給藥各組則分別加入200 μl含不同濃度(3、10、30、100 μmol/L)的PPL I的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4h，結(jié)束培養(yǎng)。使用Bio-Rad酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光值。計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率/% =(試驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5 EdU 試劑盒檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖 細(xì)胞接種及給藥流程同細(xì)胞增殖率檢測(cè)，待不同濃度的重樓皂苷(3、10、30 μmol/L)作用于成骨細(xì)胞48 h 后，依據(jù)EdU試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用奧林帕斯熒光顯微鏡采集圖像。

6 堿性磷酸酶( ALP) 活性測(cè)定 將大鼠原代成骨細(xì)胞(2×104/孔)接種于24孔板內(nèi)。待細(xì)胞充分貼壁(12 h)后，換用含3、10、30 μmol/L PPL I的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h或72 h。依照堿性磷酸酶試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。使用美國(guó)Beckman公司DU800型紫外分光光度計(jì)測(cè)定各組在520 nm處吸光度，換算為ALP活力單位，并檢測(cè)每個(gè)樣品的蛋白含量，結(jié)果用U/mg蛋白表示。

7 免疫印跡法測(cè)定OPG與RANKL的表達(dá) 待細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，使用細(xì)胞刮刮取收集實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞，加入RIPA(含PMSF蛋白酶抑制劑，碧云天公司)細(xì)胞裂解液提取總蛋白，用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。以30 μg/孔的量上樣，接著行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜。在室溫下采用5%脫脂牛奶封閉NC膜2 h后，NC膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加一抗OPG (1∶200)，RANKL(1∶200)，β-actin(1∶1000) 室溫孵育30 min 后4℃ 過(guò)夜，TBST洗膜后加1∶6 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，TBST及TBS洗膜后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，選擇單因素方差分析(ANOVA)的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PPL I能夠促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞增殖 與對(duì)照組相比，3、10、30、100 μmol/L的重樓皂苷作用于細(xì)胞24 h后均能促進(jìn)成骨樣細(xì)胞增殖(P<0.01)，見(jiàn) 表1。 EdU結(jié)果(圖1) 再次表明PPL I能夠有效地刺激大鼠原代成骨細(xì)胞的增殖。

表1 PPL I對(duì)大鼠原代成骨細(xì)胞增殖的影響(n=3，%)

紅色信號(hào)顯示處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞，藍(lán)色信號(hào)顯示細(xì)胞核;A:對(duì)照組; B:PPL I 3 μmol/L; C:PPL I 10 μmol/L; D:PPL I 30 μmol/L

圖1 EdU 檢測(cè)PPL I對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響 (×200)

2 PPL I能夠上調(diào)大鼠原代成骨細(xì)胞的ALP 活性 PPL I (3、10、30μmol/L) 作用于細(xì)胞48 h 或72 h 后，細(xì)胞的ALP 活性均顯著升高。在48 h 與72 h 時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞的ALP 活性分別為: ( 0.21 ± 0.02)、(0.22 ± 0.02) U/mg 蛋白。而加入重樓皂苷(3、10、30 μmol/L) 48 h 后，ALP 活性分別為( 0.26 ± 0.02)、( 0.33 ± 0.04)、( 0.43 ± 0.03) U/mg 蛋白; 72 h 后，分別為( 0.31 ± 0.02)、( 0.38± 0.02)、 ( 0.49 ± 0.04) U/mg 蛋白。與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 PPLI對(duì)大鼠原代成骨細(xì)胞中OPG，RANKL的蛋白表達(dá)的作用 Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PPL I (3、10、30 μmol/L) 處理大鼠原代成骨細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞中RANKL的蛋白表達(dá)明顯降低，OPG的表達(dá)明顯升高。該作用呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性 (圖2) 。

圖2 PPL I對(duì)大鼠原代成骨細(xì)胞OPG與RANKL的蛋白表達(dá)水平的影響

討 論

骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題。在發(fā)達(dá)國(guó)家，例如美國(guó)和瑞典，老年人骨質(zhì)疏松的患病率分別為13%～18%和21.2%[5-6]。在中國(guó)，老年人骨質(zhì)疏松的平均患病率估計(jì)為15.7%，隨著總?cè)丝谀挲g的增長(zhǎng)，骨質(zhì)疏松的患病率逐漸增加[7]。截至2013年底，中國(guó)60歲及以上老年人約為2.0243億患骨質(zhì)疏松癥[7]。

重樓為百合科植物云南重樓的干燥根莖，味苦、微寒、有小毒、歸肝經(jīng)[4]?，F(xiàn)己從重樓中分離并鑒定了50多種化合物，主要有甾體皂普、植物甾醇、黃酮苷、蛻皮激素及多糖等，還含有19種氨基酸和30多種微量元素[8]。本品提取物具有止血、抗炎、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等作用。重樓在消腫止痛與抗跌打損傷方面有良效，是云南白藥的主要成分之一，其主要化學(xué)成分為甾體皂苷，約占總化合物數(shù)目的80%。

本研究表明: PPL I可通過(guò)降低RANKL的蛋白表達(dá)，升高成骨細(xì)胞中OPG的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞的增殖、并上調(diào)其成骨活性。提示PPL I具有防治骨質(zhì)疏松潛能。

成骨細(xì)胞在骨骼損傷修復(fù)以及骨質(zhì)發(fā)育中起到了關(guān)鍵作用，它是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。該研究中，所用的原代成骨細(xì)胞提取自新生大鼠顱蓋骨。與細(xì)胞系相比，原代細(xì)胞無(wú)論在生物學(xué)特性方面還是在對(duì)藥物刺激的反應(yīng)方面均更為接近在體模型。細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果表明: 與對(duì)照組相比，PPLI ( 3、10、30、100 μmol/L) 能夠顯著地、濃度依賴(lài)性地促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞增殖。為了較為清晰地研究相關(guān)機(jī)制，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用3、10、30 μmol/L這三個(gè)濃度。EdU試驗(yàn)結(jié)果再次提示PPL I能夠有效地促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。隨后，筆者選擇ALP這個(gè)指標(biāo)，研究PPL I對(duì)成骨細(xì)胞成骨活性的影響，發(fā)現(xiàn)PPL I能夠明顯升高細(xì)胞中的ALP 活性。上述結(jié)果提示:在重樓促進(jìn)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中，PPL I促進(jìn)成骨樣細(xì)胞增殖可能發(fā)揮著重要作用。由于在防治骨質(zhì)疏松中，成骨細(xì)胞的增殖發(fā)揮了重要作用，故本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)PPLI如何促進(jìn)成骨細(xì)胞細(xì)胞增殖的機(jī)制作進(jìn)一步的探討。

骨保護(hù)蛋白 (OPG)/核因子-κB 受體活化因子配體(Receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)/核因子-κB 受體活化因子( Receptor activator of NF-κB, RANK) 軸在骨吸收和骨形成偶聯(lián)中發(fā)揮了十分重要的作用。OPG是已知唯一的與成骨細(xì)胞細(xì)胞膜上的RANKL結(jié)合的餌受體，它通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制RANKL與RANK的結(jié)合，阻止由成骨細(xì)胞引發(fā)的破骨細(xì)胞前體分化、存活與融合，發(fā)揮誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，抑制成熟破骨細(xì)胞活化的作用[9-11]。因此，在骨重建中，RANKL-RANK-OPG維持著骨吸收與骨形成動(dòng)態(tài)平衡。本研究中，Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: PPL I能夠有效地上調(diào)成骨細(xì)胞中OPG的蛋白水平，并下調(diào)RANKL的蛋白水平。提示PPL I可能通過(guò)影響RANKL-RANK-OPG的活性來(lái)調(diào)節(jié)并影響成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞功能平衡，并最終發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松的作用。

本研究觀察到PPL I能夠促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞的增殖，并上調(diào)其成骨活性；升高成骨細(xì)胞中OPG的表達(dá)，并降低RANKL的蛋白表達(dá)。鑒于成骨細(xì)胞增殖與活化在運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中發(fā)揮的重要作用，筆者推測(cè)重樓中的皂苷部分能通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與活化發(fā)揮修復(fù)損傷的作用。下一步，筆者計(jì)劃采用大鼠骨質(zhì)疏松模型(去卵巢和/或尾吊失重模型)，觀察重樓皂苷I的體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松活性及相關(guān)機(jī)制。