汪翰林，魏俊淑，李晨輝，景亞萍，趙 唐，張學(xué)貴，張春江,*

（1.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅億鴻生物科技有限公司，甘肅 蘭州 730000）

亞麻籽富含多種生物活性組分，能夠潛在調(diào)節(jié)結(jié)腸的微生物環(huán)境。包括碳水化合物（短鏈脂肪酸的前體）、抗氧化和抗炎癥反應(yīng)的酚類化合物以及ω-3多不飽和脂肪酸（α-亞麻酸），其中ω-3脂肪酸能降低心血管和炎癥性疾病的患病風(fēng)險。亞麻籽的含油量為35%～46%，其中45%～58%為亞麻酸[1]。

與身體其他器官相比，大腸的微生物密度最高，在成人腸道內(nèi)，微生物數(shù)量高達(dá)1014，其中包括雙歧桿菌和乳桿菌等有益菌在內(nèi)的腸道微生物群落，越來越多研究證明，腸道菌群能夠影響胃腸疾病及其他疾病。食品和主要含有益生菌和/或益生元的發(fā)酵乳制品可能以改變結(jié)腸微生物群落的方式預(yù)防多種疾?。òńY(jié)腸直腸癌）[2]。在過去10 年中，科學(xué)家和臨床醫(yī)生都認(rèn)識到微生物，尤其是繁殖于胃腸道的微生物在宿主代謝和保護(hù)功能中的重要性[3]。事實上，成年人的腸道微生物群落被認(rèn)為是宿主的輔助器官，為人體的健康做出重大的貢獻(xiàn)[4]。腸道微生物作為人體最為龐大的微生態(tài)系統(tǒng)，其代謝產(chǎn)物不僅對人體健康起到重要作用，并在膳食和宿主之間架起橋梁作用。

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）是指碳鏈中碳原子數(shù)小于6的脂肪酸，包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸。人體內(nèi)的SCFA主要為乙酸、丙酸和丁酸，約占SCFA總量的90%～95%。SCFA可以降低腸道內(nèi)環(huán)境的pH值，抑制有害菌的生長。腸道菌群可以利用各種營養(yǎng)物質(zhì)代謝分解產(chǎn)生SCFA，調(diào)節(jié)腸道功能，促進(jìn)機(jī)體免疫[5]。

Lagkouvardos等[6]研究發(fā)現(xiàn)，健康成年男性在攝入亞麻籽（攝入量0.3 g/（kg·d））1 周后，體內(nèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，同時，研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)優(yōu)勢菌群與SCFA含量變化有密切的關(guān)系。另外，在過往的哺乳動物實驗中，亞麻籽的攝入可以減少腸道有害菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌，同時增加SCFA含量，輔助抵抗結(jié)腸炎、結(jié)腸癌等腸道疾病[7-18]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞麻籽粉購自內(nèi)蒙古益善園生物科技有限責(zé)任公司。產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號：Q/NYSY 0002；生產(chǎn)許可證號：QS1501 1801 0130；生產(chǎn)日期：2017年2月25日。每100 g亞麻籽粉含有6.3～6.6 g 水、18.0～20.3 g蛋白質(zhì)、34.0～37.1 g脂肪、33.6～37.2 g總碳水化合物，以及少量的鈣、磷、鐵等元素。

SCFA標(biāo)準(zhǔn)品（乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、2-乙基丁酸） 北京中科質(zhì)檢生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

糞便收集盒 江蘇大唐醫(yī)療器械有限公司；SP-3400氣相色譜儀 北京北分瑞利分析儀器責(zé)任有限公司；TG16-WS離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D雙人凈化工作臺 上海蘇凈實業(yè)有限公司；ABI GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 上海普迪生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 受試者篩選標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：1）民族為漢族，年齡為20～25 周歲；2）心、腎、肝、肺等主要器官功能正常；3）依存性良好，自愿接受此研究，并簽署書面知情同意書；4）無煙酒等不良嗜好。

排除標(biāo)準(zhǔn)：1）飲食不規(guī)律者；2）對亞麻籽粉產(chǎn)生過敏反應(yīng)者；3）患有糖尿病等代謝性疾病者；4）同時期攝入益生菌或麥片等亞麻籽類似物者；5）在之前2個月接受抗生素治療者，或正在接受抗生素治療者；6）不按規(guī)定服用亞麻籽而影響療效的受試者，或是因為工作環(huán)境改變服用情況者。

經(jīng)過嚴(yán)格的篩選后，得到受試者總共23 名：15 名男士，編號依次為1～15；8 名女士，編號依次為16～23。按規(guī)定攝入亞麻籽粉0.6 g/（kg·d）[6]，溫水送服，為期21 d。

1.3.2 采集糞便樣品

規(guī)范受試者飲食，持續(xù)為期7 d的適應(yīng)期，收集各受試者攝入亞麻籽粉前的糞便樣本；經(jīng)過21 d的亞麻籽粉干預(yù)后，再次收集各受試者攝入亞麻籽粉后的糞便樣本。采集糞便時，需要新鮮的、中后段、內(nèi)部的糞便樣本。將樣本儲存在－80 ℃條件下。

1.3.3 腸道菌群16S rRNA高通量測序

取出糞便樣品，準(zhǔn)確稱取一定量，根據(jù)糞便DNA提取試劑盒操作說明書提取糞便菌群全基因組DNA?；诩?xì)菌16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)域，合成帶有Barcode的引物，進(jìn)行MiSeq PCR擴(kuò)增，引物序列為：515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’；806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。并使用Mothur軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.4 SCFA含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)品制備：用萬分之一天平分別稱取適量的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸，配制成母液，然后分別取一定量的母液混合，配制成質(zhì)量濃度為10、50、100、200、500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合液。

樣品制備：取糞便樣品0.5 g置于10 mL離心管中，加入5 mL純水溶解，振蕩2.0 min，3 000×g離心10 min。取1 mL上清液于1.5 mL離心管中，加入0.2 mL去蛋白溶液（含內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%偏磷酸），4 ℃、10 000×g離心10 min，取上清液。

氣相色譜條件：FFAP柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為高純氮氣（99.999%），流量0.8 mL/min；輔助氣為高純氫氣（99.999%）；柱溫：恒溫120 ℃；氣化室溫度：250 ℃；FID檢測器溫度：250 ℃；分流比40∶1；進(jìn)樣量：1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻籽粉攝入對健康成年人腸道菌群的影響

2.1.1 糞便菌群PCR擴(kuò)增

圖1 46 個糞便樣品的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis chart of 46 fecal samples after PCR amplification

由PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1）可知，每個樣本的電泳結(jié)果圖顯示PCR產(chǎn)物目的條帶清晰、大小一致、濃度正常，可進(jìn)行后續(xù)的測序?qū)嶒灐?/p>

2.1.2 亞麻籽粉攝入前后糞便菌群微生物多樣性分析

可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）是為了便于生物信息統(tǒng)計分析，將所有序列歸類操作成多個小組，即通常在相似度97%水平上聚類成OTU。通過對樣本進(jìn)一步的多樣性分析，使用統(tǒng)計學(xué)分析指數(shù)分析群落的物種多樣性和相對豐度，包括菌群豐度指數(shù)（Chao、Ace）、菌群多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）、測序深度指數(shù)（Coverage），其中Shannon則是用來估測樣本中微生物的多樣性指數(shù)之一，Shannon指數(shù)的數(shù)值與微生物多樣性成正比，其值越大，說明微生物群落多樣性越大。

表1 OTU聚類多樣性分析結(jié)果匯總Table1 Summary of OTU cluster diversity analysis

從表1中可以看出，攝入亞麻籽后，有13 位（約56.52%）受試者的OTU數(shù)目得到提高；攝入亞麻籽粉后，有14 位（約60.87%）受試者的Shannon指數(shù)增加，微生物菌群多樣性得到提高。

2.1.3 亞麻籽粉攝入對健康成年人腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.1.3.1 門水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化

在正常人體糞便中存在著四大主要的細(xì)菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）以及放線菌門（Actinobacteria）。

圖2 門水平菌群結(jié)構(gòu)相對豐度圖Fig.2 Relative abundance of intestinal microbial community at phylum level

從圖2可以看出，攝入亞麻籽粉前后，受試者糞便菌群四大菌門的豐度發(fā)生了變化，其中厚壁菌門的改變最為明顯，說明亞麻籽粉的攝入會改變健康成年人的菌群結(jié)構(gòu)。

表2 厚壁菌門、擬桿菌門相對豐度及F/BTable2 Relative abundance of Firmicutes and Bacteroidetes and F/B

在四大主要菌門中，厚壁菌門和擬桿菌門在腸道中占絕對優(yōu)勢，因此二者的比值（F/B）能夠很好地反映菌群在門水平上結(jié)構(gòu)的改變。由表2可以看出，23 位受試者中有15 位（約65.22%）的F/B值得到提高。

2.1.3.2 屬水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化

表3 屬水平上腸道菌群OTU數(shù)Table3 Number of OTU in intestinal flora at genus level

表3為攝入亞麻籽粉前、后，健康成年人腸道菌群結(jié)構(gòu)變化較為明顯的部分菌屬。依次為Akk菌屬（Akkermansia）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、放線菌（Actinomyces）、擬桿菌屬（Bacteroides）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）以及乳球菌屬（Lactococcus）。其中，73.91%受試者在亞麻籽攝入后，雙歧桿菌屬的OTU數(shù)急劇下降。說明，亞麻籽粉的攝入有可能會降低健康成年人腸道中雙歧桿菌屬的數(shù)量。

2.2 亞麻籽粉攝入對健康成年人糞便SCFA的影響

2.2.1 SCFA標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.3.4節(jié)中的方法進(jìn)行檢測，以峰面積比對其相應(yīng)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表4，乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸在對應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999。

表4 SCFA的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table4 Linear equations and correlation coefficients for SCFA

2.2.2 糞便中SCFA含量

圖3 攝入亞麻籽前后糞便SCFA含量的變化Fig.3 Changes in SCFA in feces before and after the intake of flaxseed

由圖3可知，與攝入亞麻籽粉前相比，健康成年人糞便中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸含量在攝入亞麻籽后都得到了增長，其中乙酸、丙酸、丁酸含量增長顯著（P＜0.05）。說明亞麻籽的攝入可以上調(diào)健康成年人糞便中SCFA的含量。

3 討 論

亞麻籽的補充攝入會改變健康嚙齒動物的基本結(jié)腸微環(huán)境。亞麻籽飲食能夠引起小鼠的糞便微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著變化，與普通飼料喂養(yǎng)的小鼠相比，亞麻籽喂養(yǎng)的小鼠的丁酸鹽產(chǎn)生菌——玫瑰紅菌的豐度增加了近10 倍，這與亞麻籽飼養(yǎng)組觀察到的盲腸和糞便丁酸鹽含量增加是一致的[8]；此外，能夠?qū)⒅参锬局剞D(zhuǎn)化為哺乳動物木脂素的一種物質(zhì)在亞麻籽喂養(yǎng)的小鼠體內(nèi)含量增加了3 倍[9-10]。雖然亞麻籽飲食對有益雙歧桿菌或乳桿菌的相對豐度沒有顯著影響[11]，但是亞麻籽飲食減少了潛在有害細(xì)菌種類的豐度，如產(chǎn)氣莢膜梭菌[12]。表明亞麻籽飲食可以改變特定腸道菌群的豐度，可能有益于腸道微環(huán)境。Power等[8]的研究表明，在健康的C57BL/6小鼠中，10%亞麻籽飲食攝入，導(dǎo)致小鼠結(jié)腸微環(huán)境的變化，但其對于小鼠腸道微環(huán)境的益處受到爭議。在其他報道中發(fā)現(xiàn)，亞麻籽攝入會導(dǎo)致一些腸道相關(guān)病理學(xué)結(jié)果如結(jié)腸癌腸道微環(huán)境產(chǎn)生一些變化[14-19]，而這些變化極有可能會加重結(jié)腸炎的病情[13]。

在本實驗中，通過比較健康成年人攝入亞麻籽粉前后的腸道菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門的數(shù)量變化最為明顯。在過去的一些研究中證明，厚壁菌門與腸道吸收營養(yǎng)息息相關(guān)，肥胖人體內(nèi)厚壁菌門一般維持一個較高的比例，且菌群多樣性程度較差，同時厚壁菌門對細(xì)菌種類的比例增加可能有助于肥胖的病理生理學(xué)，肥胖的嚴(yán)重程度往往與厚壁菌門占比呈正相關(guān)[20]。值得注意的是本次實驗中厚壁菌門較高的8 位受試者（2、6、8、9、12、18、21、23號）也屬于偏胖體質(zhì)，而亞麻籽的攝入降低了這些受試者厚壁菌門的相對豐度，這說明了亞麻籽可能有利于調(diào)節(jié)肥胖人群的腸道菌群。

雙歧桿菌是一種益生菌，具有預(yù)防腸胃感染、抵抗有害微生物活性的功效，還可以抑制多種菌群（埃希氏大腸桿菌、輪狀病毒等）引起的腹瀉[21-23]。本研究中，在屬水平腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)，亞麻籽的攝入明顯降低了個體腸道內(nèi)雙歧桿菌的含量，這表明亞麻籽攝入可能會降低健康成年人腸道菌群中雙歧桿菌的比例。

Akkermansia菌屬是腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌屬，是一種黏蛋白降解細(xì)菌，對宿主的代謝具有有益的影響，在物種水平上，Akkermansia菌屬的豐度已被證明與小鼠和人類的肥胖以及I型糖尿病呈負(fù)相關(guān)，可以通過口服給Akkermansia菌來改善脂肪組織代謝和腸屏障功能來預(yù)防肥胖，Akkermansia菌屬的增加可能會阻止與肥胖相關(guān)的負(fù)面代謝表型的產(chǎn)生[24]。在本實驗中，4號受試者在攝入亞麻籽粉后腸道菌群內(nèi)出現(xiàn)了大量的Akkermansia菌屬，表明亞麻籽的攝入可能會提高健康成年人腸道菌群中Akkermansia菌屬的比例，有利于改善腸道功能，預(yù)防肥胖。

通過對攝入亞麻籽粉前后健康成年人糞便SCFA含量分析（圖3），發(fā)現(xiàn)亞麻籽的攝入對健康成年人糞便SCFA中的乙酸、丙酸、丁酸含量具有明顯的上調(diào)作用。這3 種脂肪酸對于人類腸道健康有促進(jìn)細(xì)胞代謝、抑制腫瘤等積極作用。其中乙酸是健康成年人腸道內(nèi)多數(shù)厭氧菌的代謝產(chǎn)物，大部分乙酸通過匯入血液進(jìn)行能量代謝，是人體從小腸無法吸收的碳水化合物中獲取能量的主要代謝途徑[25]。丙酸主要由擬桿菌門分泌產(chǎn)生，能夠抑制人體內(nèi)膽固醇水平的下調(diào)[26]。丁酸主要由厚壁菌門分泌產(chǎn)生，可以作為結(jié)腸的能量來源[27]，同時也具備抗結(jié)腸癌的作用，丁酸鹽會增加癌細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白酶的表達(dá)，并抑制腸道腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[28]。SCFA能夠降低腸道的pH值，使腸道環(huán)境偏酸性，這有利于有益菌的生長，同時會抑制有害菌的繁殖[29]。最近的研究也表明，在細(xì)胞水平上，腸道微生物會通過上調(diào)SCFA的水平，平衡輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例來改善腸道炎癥[30]；而本實驗中，通過攝入亞麻籽粉，健康成年人糞便中SCFA的水平上升，說明亞麻籽攝入可以上調(diào)SCFA的水平，對調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、活化腸道細(xì)胞代謝、抑制腸道疾病都有積極的影響。

本研究證明，亞麻籽的攝入可以改變健康成年人腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加腸道微生物菌群多樣性，同時可以促進(jìn)腸道內(nèi)SCFA的產(chǎn)生，從而維持腸道微環(huán)境，抑制腸道疾病的發(fā)生。并且亞麻籽的攝入可以降低高比例厚壁菌門的占比以及增加Akkermansia菌屬的比例，可能有利于預(yù)防肥胖癥的風(fēng)險。另外，亞麻籽的攝入也可能會降低腸道內(nèi)有益菌——雙歧桿菌的比例。綜上所述，亞麻籽粉無論是對小鼠還是對人體的作用似乎都呈現(xiàn)出雙刃劍的效果，其直接作用還需進(jìn)一步的研究。