裘紀(jì)瑩，魏朝治,2，陳相艷，楊金玉，張 翔，陳蕾蕾，王易芬,*，李大鵬*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018）

銀杏花粉是銀杏雄株的花粉，其主要活性成分為黃酮類化合物[1-2]。銀杏花粉總黃酮含量約為21.40 mg/g[3]，遠(yuǎn)高于油菜蜂花粉（14.306 mg/g）、玉米蜂花粉（5.445 mg/g）、蘋果蜂花粉（8.462 mg/g）等蜂花粉產(chǎn)品[4]。銀杏花粉黃酮主要以黃酮-O-糖苷的形式存在，其中黃酮苷元主要為山柰酚以及少量的槲皮素和異鼠李素，山柰酚約占3 種苷元總量的96.71%，其連接的糖主要為D-葡萄糖、L-鼠李糖或者兩者的結(jié)合，并且多與黃酮苷元的3、7、4’位羥基相連[5]。

癌癥、糖尿病、心腦血管疾病、老年癡呆癥等疾病是目前人類的多發(fā)病，這些疾病的發(fā)生都與由自由基引起的氧化損傷有關(guān)[6]。黃酮類化合物是一種良好的天然來源抗氧化劑，廣泛存在于植物界，尤其是中藥材中，能夠直接清除體內(nèi)自由基、螯合金屬離子、促進(jìn)抗氧化因子再生和提高抗氧化酶的水平等，因而備受關(guān)注[7-9]。同時(shí)，其抗氧化活性與結(jié)構(gòu)有著很大的關(guān)系，如羥基數(shù)目與位置、雙鍵位置、糖苷鍵結(jié)構(gòu)等[10]。

生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是近年來發(fā)展起來的，可以通過改變黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)從而改變其物理化學(xué)性質(zhì)、提高其生物利用率和功能活性的方法。研究證實(shí)，通過生物轉(zhuǎn)化，黃酮糖苷可被轉(zhuǎn)化為苷元，更易被人體吸收利用，而且黃酮苷元清除人體自由基的活性明顯優(yōu)于黃酮糖苷[11-13]。本研究在前期篩選到一株生物轉(zhuǎn)化銀杏花粉黃酮苷菌株——惡味乳桿菌B2（Lacbacillus perolens B2）的基礎(chǔ)上，研究其生物轉(zhuǎn)化對銀杏花粉黃酮組分及其體外2,2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（2-2’-azino-bis-(3-ethyl-benzthia-zoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和減緩由于H2O2損傷引起的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡的影響，以期為深入利用銀杏花粉資源、開發(fā)高活性抗氧化產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏花粉采自山東郯城，干燥過100 目篩；L. perolens B2由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所食品微生物實(shí)驗(yàn)室從手工泡菜中分離，經(jīng)過菌株鑒定并凍存保種；RAW264.7細(xì)胞購于美國模式菌種收集中心細(xì)胞庫，凍存保種。

ABTS、DPPH、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）浙江天杭生物科技有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基 美國Gibco公司；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

NE-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會(huì)社；6132型核酸蛋白測定儀 德國Eppendorf公司；MK3型酶標(biāo)儀 上海熱電儀器有限公司；UV-160型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；HF90型CO2培養(yǎng)箱 上海力申科學(xué)儀器有限公司；TE2000倒置相差顯微鏡 日本尼康公司；1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 銀杏花粉黃酮苷的生物轉(zhuǎn)化

L. perolens B2接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，混勻并取一環(huán)于MRS平皿劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑單菌落復(fù)劃線于MRS平皿，傳代2 次即為活化菌株。活化后的菌株取一環(huán)接種于5 mL MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液OD600nm為0.4，即為種子液。

1 kg銀杏花粉加4 L去離子水，混勻后于121 ℃滅菌20 min。按2%的接種量接種種子液，混勻后于37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)72 h，所得發(fā)酵培養(yǎng)物即為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

1.3.2 銀杏花粉及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取物及萃取物制備

銀杏花粉原料及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別以加熱回流提取，具體條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶10，提取溫度75 ℃，提取時(shí)間2 h，提取3 次。最后合并濾液，減壓濃縮，并冷凍干燥，得到銀杏花粉提取物（c-1）和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物提取物（c-2）。提取物加水重懸，石油醚與水1∶1（V/V）萃取3 次，上層石油醚相減壓濃縮，凍干，得到銀杏花粉石油醚萃取物（p-1）和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物石油醚萃取物（p-2）。下層水相依次加乙酸乙酯、正丁醇1∶1（V/V）萃取3 次，減壓濃縮，凍干，分別得到銀杏花粉乙酸乙酯萃取物（e-1）和正丁醇萃取物（n-1），以及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物（e-2）和正丁醇萃取物（n-2）。

1.3.3 提取物及萃取物的高效液相色譜檢測

采用1260型高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，配置二極管陣列檢測器，具體操作及參數(shù)見文獻(xiàn)[5]，同一保留時(shí)間峰面積越大表示含量越高。

1.3.4 ABTS+·清除能力

參考文獻(xiàn)[14-15]的方法并稍作修改。待測樣品采用100%甲醇溶解并定容至2 mg/mL，其中p-1和p-2樣品定容至4 mg/mL，并稀釋制成不同質(zhì)量濃度的待測液。以山柰酚為對照，測定c-1、c-2、p-1、p-2、e-1、e-2、n-1和n-2樣品的ABTS+·清除能力。具體操作為：將7 mmol/L ABTS水溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫下避光反應(yīng)16 h，使用前用無水乙醇稀釋，在734 nm波長處測定吸光度，調(diào)整混合液的吸光度為0.80±0.05，制成ABTS工作液。將10 μL不同質(zhì)量濃度的供試品溶液加入96 孔板，然后每孔快速加入290 μL ABTS工作液，輕微振蕩混勻，立刻于黑暗中常溫反應(yīng)15 min，測定實(shí)驗(yàn)組在734 nm波長處的吸光度。以無水乙醇代替樣品測定空白組吸光度，以無水乙醇代替ABTS工作液測定背景組吸光度。ABTS+·清除率按公式（1）計(jì)算。

式中：A1表示實(shí)驗(yàn)組吸光度；A0表示空白組吸光度；AB表示背景組吸光度。

根據(jù)測定的清除率計(jì)算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）以比較樣品之間ABTS+·清除能力。

1.3.5 DPPH自由基清除能力

待測樣品采用100%甲醇溶解并定容至2 mg/mL，其中p-1和p-2樣品定容至4 mg/mL，并稀釋制成不同質(zhì)量濃度待測液。以山柰酚為對照，測定c-1、c-2、p-1、p-2、e-1、e-2、n-1和n-2樣品的DPPH自由基清除能力。具體操作為：稱取一定量的DPPH用純甲醇溶解并定容至終濃度100 μmol/L，4 ℃避光保存。DPPH自由基清除率的測定和計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[2]。將不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與DPPH溶液等體積混合，室溫下避光靜置30 min后測定實(shí)驗(yàn)組在517 nm波長處的吸光度，測定DPPH溶液與無水甲醇等體積混合的空白組吸光度，以及對應(yīng)樣品溶液與無水甲醇等體積混合的背景組吸光度。DPPH自由基清除率按公式（2）計(jì)算。

式中：A1表示實(shí)驗(yàn)組吸光度；A0表示空白組吸光度；AB表示背景組吸光度。

根據(jù)測定的清除率計(jì)算IC50以比較樣品之間DPPH自由基清除能力。

1.3.6 對H2O2損傷RAW264.7細(xì)胞的保護(hù)作用

1.3.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞生長于含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2環(huán)境下傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為30 代內(nèi)。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96 孔板，調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)約為6×104個(gè)。96 孔板于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁，移去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗1 次，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.6.2 H2O2損傷模型的建立

H2O2損傷模型的建立按照文獻(xiàn)[16]的方法并稍作修改。已接種RAW264.7細(xì)胞的96 孔板中加入100 μL含有不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 mmol/L）H2O2溶液的培養(yǎng)基，每個(gè)樣品做4 個(gè)復(fù)孔。以加入100 μL DMEM培養(yǎng)基的孔為空白組，37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，加入150 μL DMSO，輕輕振蕩使紫色結(jié)晶溶解，室溫反應(yīng)10 min后用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定OD值。細(xì)胞抑制率按公式（3）計(jì)算。

式中：OD1表示實(shí)驗(yàn)組OD值；OD0表示空白組OD值。

1.3.6.3 銀杏花粉樣品質(zhì)量濃度的篩選

待測樣品采用DMSO溶解并定容至2 mg/mL，并用DMSO進(jìn)一步稀釋制成不同質(zhì)量濃度待測液。在已接種RAW264.7細(xì)胞的96 孔板中加入100 μL含有不同質(zhì)量濃度（10、20、30、40、50、100 μg/mL）c-1、c-2、e-1、e-2樣品的培養(yǎng)基，每個(gè)樣品做4 個(gè)復(fù)孔。以加入100 μL DMEM培養(yǎng)基的孔為空白組，37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，加入150 μL DMSO，輕輕振蕩使紫色結(jié)晶溶解，室溫反應(yīng)10 min后用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定OD值，并按公式（3）計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.3.6.4 銀杏花粉樣品對H2O2損傷RAW264.7細(xì)胞的保護(hù)作用

在已接種RAW264.7細(xì)胞的96 孔板中加入100 μL含有0.2 mmol/L H2O2溶液和不同質(zhì)量濃度（5、10、15 μg/mL）c-1、c-2、e-1、e-2樣品的培養(yǎng)基，每個(gè)樣品做4 個(gè)復(fù)孔。以加入100 μL DMEM培養(yǎng)基的孔為空白組，以加入含0.2 mmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基的孔為損傷組，37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，加入150 μL DMSO，輕輕振蕩使紫色結(jié)晶溶解，室溫反應(yīng)10 min后用酶標(biāo)儀于490 nm處測定OD值，并按公式（3）計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏花粉及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取物和萃取物制備結(jié)果

前期篩選到一株L. perolens B2可生物轉(zhuǎn)化銀杏花粉黃酮苷，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件對銀杏花粉進(jìn)行發(fā)酵得到生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，對銀杏花粉原料以及生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行提取和萃取，各部位的得率如表1所示。

表1 銀杏花粉及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取物和萃取物的得率Table1 Yields of the crude extract, its biotransformation product and their fractions from Ginkgo biloba pollen

從表1可知，銀杏花粉通過生物轉(zhuǎn)化，提取物及其各相萃取物的得率均大幅度提高。這是由于銀杏花粉具有堅(jiān)硬的孢壁[17]，活性成分被牢牢包裹在內(nèi)部，同時(shí)其被花粉內(nèi)部的蛋白、多糖等其他大分子成分包裹，活性成分不容易被提取。而乳酸菌可以分泌復(fù)雜的酶系[18-20]，分解孢壁中的部分成分，從而使孢壁形成孔洞，有利于活性成分的溶出。同時(shí)，乳酸菌具有分解蛋白質(zhì)、多糖等大分子成分的能力，從而可以使花粉更好地釋放活性成分，提高活性成分提取物的得率，因此也相應(yīng)提高了各相萃取物的得率。

2.2 提取物及萃取物的高效液相色譜圖分析

圖1 銀杏花粉及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取物及萃取物的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of the crude extract,its biotransformation product and their fractions from G. biloba pollen

研究報(bào)道銀杏花粉主要抗氧化組分為黃酮類化合物，其中含量較高的為山柰酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和山柰酚，根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，上述黃酮類化合物分別對應(yīng)圖1標(biāo)注的色譜峰1～5。通過比較圖1A中c-1和c-2的高效液相色譜圖發(fā)現(xiàn)，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物提取物中組分1、2、3的含量下降，其中山柰酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷（峰1）含量明顯降低，同時(shí)組分4、5含量升高，尤其是山柰酚（峰5）含量明顯升高。可見，通過L. perolens B2的生物轉(zhuǎn)化，銀杏花粉中的組分1、2、3被轉(zhuǎn)化為組分4、5。文獻(xiàn)[21]報(bào)道乳酸菌可分泌β-D-葡萄糖苷酶，因此可能是因?yàn)楹Y選的L. perolens B2可分泌β-D-葡萄糖苷酶，并且酶活力較高，組分1、3通過葡萄糖苷鍵的斷裂釋放出組分5。同理，組分2可被轉(zhuǎn)化為組分4，但可能L. perolens B2的α-L-鼠李糖苷酶活力較低，從而導(dǎo)致組分4有積累的現(xiàn)象。圖1B為石油醚相萃取物，黃酮組分峰面積大幅降低，表明其對黃酮類化合物沒有富集作用，但可萃取出提取物中的油溶性雜質(zhì)。圖1C為正丁醇相萃取物，n-1樣品中富集了大量的組分1、2，而n-2樣品中組分1、2的含量很少，表明通過生物轉(zhuǎn)化，上述化合物被充分轉(zhuǎn)化為其他組分。圖1D為乙酸乙酯相萃取物，e-1樣品中主要富集了組分4，而e-2樣品中不僅富集了組分4，更富集了大量的組分5。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[22-23]基本一致，由于萃取溶劑的極性不同，根據(jù)“相似相溶”原理，乙酸乙酯相萃取物中的黃酮組分主要為黃酮醇及極性較低的黃酮苷，而正丁醇相中的黃酮組分主要為極性較高的黃酮苷。

2.3 體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

圖2 銀杏花粉及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取物及萃取物對ABTS＋ ·（A）和DPPH自由基（B）的清除作用Fig.2 ABTS＋· (A) and DPPH radical (B) scavenging activities of the crude extract, its biotransformation product and their fractions from G. biloba pollen

通過L. perolens B2的生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取物和各相萃取物對ABTS+·和DPPH自由基的體外清除能力均有所提高（圖2）。其中e-2樣品對ABTS+·的清除率遠(yuǎn)高于c-1（P＜0.05），同時(shí)，c-2、n-2、e-1、e-2和p-2樣品對DPPH自由基的清除率均高于c-1（P＜0.05），其中e-2樣品的DPPH自由基清除率最高?？梢?，乙酸乙酯相是銀杏花粉抗氧化活性物質(zhì)的富集部位，這與文獻(xiàn)[24-25]的報(bào)道一致。同時(shí)通過L. perolens B2的生物轉(zhuǎn)化，銀杏花粉的體外抗氧化能力得到進(jìn)一步提高，但與銀杏花粉中的主要黃酮苷元——山柰酚相比仍有明顯差距[26]。后續(xù)采用銀杏花粉及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取物（c-1、c-2）和乙酸乙酯相萃取物（e-1、e-2）開展進(jìn)一步的細(xì)胞抗氧化研究。

2.4 對H2O2損傷RAW264.7細(xì)胞的保護(hù)作用分析

2.4.1 H2O2損傷模型構(gòu)建結(jié)果

如圖3所示，隨著濃度的升高，H2O2對RAW264.7細(xì)胞的抑制率不斷提高。與對照組相比，0.1、0.2 mmol/L的H2O2對RAW264.7細(xì)胞增殖沒有顯著影響（P＞0.05）；當(dāng)濃度達(dá)到0.3 mmol/L時(shí)，H2O2對RAW264.7細(xì)胞的抑制率超過40%，對細(xì)胞增殖影響顯著（P＜0.05）。由于采用過低濃度的H2O2易造成操作誤差，或?qū)?xì)胞的氧化損傷不明顯，故選擇0.2 mmol/L H2O2進(jìn)行細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建。

圖3 H2O2對RAW264.7細(xì)胞的毒性Fig.3 Cytotoxic effects of H2O2 on RAW264.7 cells

2.4.2 銀杏花粉樣品的質(zhì)量濃度篩選結(jié)果

圖4 銀杏花粉樣品對RAW264.7細(xì)胞的毒性Fig.4 Cytotoxic effects of G. biloba pollen on RAW264.7 cells

由圖4可知，與對照組相比，10、20 μg/mL樣品對RAW264.7細(xì)胞增殖沒有顯著影響（P＞0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí)，4 種樣品對細(xì)胞增殖均具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。同時(shí)，當(dāng)e-2樣品質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，對細(xì)胞的抑制率超過20%，表明該質(zhì)量濃度的e-2樣品可能具有一定的細(xì)胞毒性，故選擇5、10、15 μg/mL的樣品質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4.3 銀杏花粉樣品對H2O2損傷RAW264.7細(xì)胞的保護(hù)作用分析

圖5 銀杏花粉樣品對H2O2損傷RAW264.7細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.5 Protective effects of G. biloba pollen against H2O2-induced damage in RAW264.7 cells

研究低、中、高質(zhì)量濃度（5、10、15 μg/mL）的c-1、c-2、e-1和e-2樣品對H2O2損傷RAW264.7細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果見圖5。供試的4 個(gè)樣品均可減緩由H2O2損傷導(dǎo)致的RAW264.7細(xì)胞凋亡，并且存在正向的劑量依賴關(guān)系，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到15 μg/mL時(shí)，4 個(gè)樣品的保護(hù)能力都達(dá)到最強(qiáng)，與損傷組相比差異顯著（P＜0.05）。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物提取物及乙酸乙酯相萃取物的保護(hù)能力均強(qiáng)于對應(yīng)銀杏花粉樣品，其中e-2樣品的保護(hù)能力最強(qiáng)，當(dāng)e-2樣品質(zhì)量濃度為15 μg/mL時(shí)，細(xì)胞抑制率為負(fù)，幾乎能夠完全保護(hù)RAW264.7細(xì)胞不受H2O2的損傷。

3 結(jié) 論

山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗抑郁等眾多功效[27-30]，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過L. perolens B2的生物轉(zhuǎn)化，銀杏花粉中的山柰酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷等主要黃酮苷被轉(zhuǎn)化為以山柰酚為代表的黃酮苷元，同時(shí)提取物及各相萃取物的得率、體外抗氧化活性及對H2O2誘導(dǎo)損傷的RAW264.7細(xì)胞的保護(hù)作用均顯著提高。其中生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的乙酸乙酯相萃取物的抗氧化活性最高，說明生物轉(zhuǎn)化后的抗氧化活性成分主要為富集于乙酸乙酯相的山柰酚。本研究為銀杏花粉資源的深入利用及開發(fā)高活性抗氧化產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。