阿依姑麗·艾合麥提，王妙穎，彭禛菲，馮雅麗，王小燕，古扎麗努爾·艾尼

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

高脂血癥是常見的心血管疾病，是動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病形成的一個(gè)主要危險(xiǎn)因子[1-2]。據(jù)報(bào)道，全球每年死于心腦血管疾病的患者大約有1 200萬 人。有研究表明，我國成年人中血脂異?；颊咭堰_(dá)1.6億 人，患病率為18.6%[3]，對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂性疾病的預(yù)防和治療能夠改善外周動(dòng)脈的病變和心腦血管疾病的發(fā)生[4]。因此，對(duì)高脂血癥的早期預(yù)防和將血脂控制于正常范圍就顯得十分重要。由于目前有效控制血脂的藥物大多為化學(xué)藥品，其有不同程度的副作用[5]，而以植物為基礎(chǔ)的非藥物飲食療法相對(duì)安全[6]；因此其越來越受到重視。

新疆的伊犁和哈密地區(qū)分布著豐富的野山杏資源，因其具有良好的防風(fēng)固沙作用，加上國家的相關(guān)政策扶持，其種植栽培面積不斷擴(kuò)大[7]，目前已超過26萬 km2；因此，對(duì)新疆野山杏這一特色資源的開發(fā)和利用具有重要的意義。對(duì)于野山杏果肉前期研究的結(jié)果表明，野山杏含有大量的膳食纖維、黃酮類[8-10]和豐富的有機(jī)酸類成分[11]，野山杏果肉總黃酮和膳食纖維具有良好的降血脂、抗氧化和保肝作用[9-10]，野山杏的總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)14.50%～27.77%，相比總黃酮（5.39%）高很多[12]，并且在臨床上應(yīng)用野山杏果肉的水煎液治療脂肪肝可以使病情得到一定程度的改善（可以減輕或改善76.19%的脂肪肝）[13]，這些研究結(jié)果提示野山杏果肉中的總有機(jī)酸是其重要的活性成分。通過研究發(fā)現(xiàn)野山杏果肉總有機(jī)酸（total organic acids from wild apricot，TOAWA）在體外呈現(xiàn)一定的抑制過氧化脂質(zhì)活性[14]以及降低高脂血癥小鼠的血脂濃度和保護(hù)肝臟的作用[15]。本研究通過考察TOAWA對(duì)高脂血癥大鼠血脂濃度、血清載脂蛋白（apoprotein，Apo）質(zhì)量濃度及肝臟中與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響，探明TOAWA的降血脂機(jī)理，旨在為將TOAWA開發(fā)為降血脂的保健食品功能因子，將野山杏開發(fā)為降血脂的功能性食品原料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（triglycerides，TG）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒、ApoA-I試劑盒、Apo-B試劑盒 南京建成生物工程研究所；血脂康膠囊 成都地奧九泓制藥廠；717陰離子交換樹脂、水合氯醛、羧甲基纖維素鈉、膽固醇、膽酸鹽、丙基硫氧嘧啶、1,2-丙二醇、吐溫-80、無水乙醇（分析純） 上海山浦化工有限公司；Prime Script II 1st Strand cDNA反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、SYBR Green Real Time PCR Master mix、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 寶生物工程大連有限公司；Trizol、AL2000 DNA Marker南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司；焦碳酸二乙酯 美國Sigma公司。

野山杏（Prunus armeniaca L.）產(chǎn)自新疆哈密伊吾縣葦子峽鄉(xiāng)。健康雌雄各半的SD大鼠，體質(zhì)量（150±20）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（新）2016-0003。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀 美國BIO-RAD公司；紫外-可見分光光度計(jì)日本島津公司；渦漩混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；熒光定量PCR儀 德國Roche公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國BECKMAN公司；紫外透射儀、恒溫水浴鍋 美國Amersham Pharmacia公司；雪花狀制冰機(jī)日本SANYO公司；超聲波藥物處理機(jī) 濟(jì)寧新百特工程機(jī)械有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；真空抽濾泵 北京萊伯泰科儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；0～4 000 r/min離心沉淀器 金壇市醫(yī)療器械廠；電子天平 梅勒特托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TOAWA的制備

野山杏果肉干粉用蒸餾水80 ℃回流提取兩次，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液用717型強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂作為吸附柱，稀HCl溶液作洗脫液進(jìn)行分離純化，再用正丁醇萃取分離，減壓回收正丁醇，殘?jiān)稍锛吹玫厣目傆袡C(jī)酸純品，采用電位滴定法[16]測(cè)定其含量為845.4 mg/g。

1.3.2 高脂乳劑及樣品溶液的制備

按文獻(xiàn)[17]制備高脂乳劑，將總有機(jī)酸和血脂康分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成相應(yīng)的質(zhì)量濃度。

1.3.3 動(dòng)物分組、造模與給藥

SD大鼠60 只，隨機(jī)分為6 組，每組10 只，雌雄各半，分為空白組、模型組、陽性組以及TOAWA低、中、高劑量組?？瞻捉M灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液（10 mL/（kg·d）），其余5 組均于每天上午灌胃高脂乳劑（10 mL/（kg·d）），其中陽性組和3 個(gè)不同劑量TOAWA組均于下午在灌胃高脂乳劑的基礎(chǔ)上，分別灌胃血脂康（0.2 g/（kg·d））和低、中、高3 個(gè)劑量（0.1、0.2、0.4 g/（kg·d））的TOAWA，實(shí)驗(yàn)周期60 d，為及時(shí)調(diào)整給藥劑量，大鼠每5 d稱體質(zhì)量一次，于末次給藥后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，心臟采血，分離血清用于血清生化指標(biāo)的測(cè)定，脫臼處死，摘取肝臟稱質(zhì)量，并按下式計(jì)算肝臟指數(shù)；同時(shí)快速分離肝右小葉供制作組織切片使用，剩余的肝臟剪下1.0～1.5 g迅速用4 ℃生理鹽水洗凈置于液氮中，用于提取肝臟DNA。

1.3.4 血清生化指標(biāo)測(cè)定

取1.3.3節(jié)制備的血清，按照試劑盒方法測(cè)定TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度以及ApoA-I、Apo-B質(zhì)量濃度，并計(jì)算ApoA-I/Apo-B，考察TOAWA對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血脂濃度及Apo質(zhì)量濃度的影響。

1.3.5 肝臟組織切片的制作和組織學(xué)檢查

取1.3.3節(jié)中分離的肝右小葉用生理鹽水洗凈，用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液固定，制作病理切片并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，生物顯微鏡（400×）觀察各組肝組織切片病理學(xué)變化。

1.3.6 肝臟組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

取1.3.3節(jié)肝臟組織，采用Trizol法提取和純化肝臟組織中的總RNA[18-19]，使用GelStain染色，采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)RNA的完整性。取RNA樣本，采用Prime Script II 1st Strand cDNA反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成的目標(biāo)產(chǎn)物cDNA置于－70 ℃保存。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定肝臟組織中與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

取1.3.6節(jié)中反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA樣本，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用SYBR GREEN染料法，以β-actin為內(nèi)參基因作定量檢測(cè)，并用2－△△Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用兩步法，程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環(huán)40 次；72 ℃單點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)。溶解曲線：95 ℃ 0 s；65 ℃ 15 s；95 ℃ 0 s，連續(xù)檢測(cè)信號(hào)。大鼠肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPAR-α）和低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDL-R）引物的設(shè)計(jì)見表1。

表1 基因引物序列Table1 Primer sequences of the genes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 TOAWA對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠的體質(zhì)量增長曲線Fig.1 Growth curve of experimental rats

圖2 TOAWA對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟指數(shù)的影響Fig.2 Effect of TOAWA on liver index of experimental rats

圖1 顯示各組實(shí)驗(yàn)大鼠的體質(zhì)量之間無明顯差異。圖2顯示，與空白組相比，模型組大鼠的肝臟指數(shù)極顯著升高（P＜0.01），說明高脂乳劑使得肝臟被脂肪浸潤，損傷肝臟；與模型組比較，TOAWA低、中、高劑量組和陽性組均可極顯著降低肝臟指數(shù)（P＜0.01），說明TOAWA能夠明顯減輕肝臟的脂肪浸潤，改善肝功能。

2.2 TOAWA對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血脂濃度的影響

圖3顯示，與空白組相比，模型組TG、TC和LDL-C濃度極顯著升高（P＜0.01），HDL-C濃度極顯著降低（P＜0.01），表明成功誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠高脂血癥模型。與模型組比較，TOAWA低、中、高劑量組與陽性組均可顯著降低TC、TG和LDL-C濃度，明顯升高HDL-C濃度，提示TOAWA能調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血脂濃度，高劑量組的作用效果更為明顯。

圖3 TOAWA對(duì)高血脂大鼠血清中血脂濃度的影響Fig.3 Effect of TOAWA on serum lipid level of hyperlipidemic rats

2.3 TOAWA對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血清Apo質(zhì)量濃度的影響

圖4 TOAWA對(duì)高血脂癥大鼠血清Apo質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effect of TOAWA on serum apolipoprotein level of hyperlipidemic rats

圖4 顯示，與空白組相比，模型組ApoA-I質(zhì)量濃度和ApoA-I/Apo-B極顯著降低（P＜0.01），Apo-B質(zhì)量濃度極顯著升高（P＜0.01），表明模型組大鼠血清Apo的質(zhì)量濃度異常。與模型組比較，TOAWA高劑量組與陽性組可極顯著升高ApoA-I質(zhì)量濃度和ApoA-I/Apo-B（P＜0.01），顯著降低Apo-B質(zhì)量濃度，低、中劑量TOAWA能夠不同程度地升高ApoA-I質(zhì)量濃度和ApoA-I/Apo-B，降低Apo-B質(zhì)量濃度，提示TOAWA通過調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血清Apo質(zhì)量濃度而影響血脂濃度，高劑量組的作用效果更為明顯。

2.4 大鼠肝臟組織的病理學(xué)觀察

圖5 TOAWA對(duì)大鼠肝臟組織病理學(xué)變化的影響（×400）Fig.5 Effect of TOAWA on pathological changes of liver tissue in rats (× 400)

圖5 顯示空白組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀且排列規(guī)律、整齊、肝竇正常，周邊肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，未見細(xì)胞膨脹及病理形態(tài)變化；與空白組相比，模型組可見肝臟體積變大，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞之間連接松散，含有較多的白色脂肪油滴，形成了空泡，細(xì)胞核被擠向一側(cè)，呈現(xiàn)明顯的脂肪性病變；給予不同質(zhì)量濃度TOAWA和血脂康灌胃后，TOAWA低、中、高劑量組的脂肪變性有不同程度的改善，細(xì)胞形態(tài)開始恢復(fù)，其中高劑量組的脂肪病變減少更為顯著，大部分細(xì)胞恢復(fù)到接近正常形態(tài)；陽性組肝索和肝竇結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈周圍肝細(xì)胞恢復(fù)放射狀且排列整齊，脂肪油滴明顯減少，肝臟切片基本恢復(fù)到正常狀態(tài)。

2.5 大鼠肝臟組織的RNA電泳檢測(cè)結(jié)果

圖6 大鼠肝臟組織的RNA電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Electrophoretic detection of RNA extracted from rat liver tissue

圖6 顯示，肝臟中RNA提取成功，采用GelStain染色及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)到RNA完整度好，可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

2.6 大鼠肝臟組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)

圖7顯示，與空白組相比，模型組的PPAR-α和LDL-R基因表達(dá)量降低，說明高脂模型組的脂質(zhì)代謝能力降低；與模型組相比，TOAWA低、中、高劑量組和陽性組PPAR-α和LDL-R基因表達(dá)量有明顯的升高，特別是高劑量組與空白組幾乎無差異，說明高劑量組大鼠脂質(zhì)代謝能力恢復(fù)到正常水平。

圖7 大鼠肝臟PPAR-α和LDL-R基因mRNA表達(dá)量Fig.7 PPAR-α and LDL-R mRNA expression in liver of rats

3 討 論

隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，飲食中蛋白和脂肪的比例增加，運(yùn)動(dòng)量相對(duì)減少[20]，導(dǎo)致血中脂肪聚積，引起脂質(zhì)代謝紊亂，而脂質(zhì)代謝紊亂誘發(fā)的高脂血癥是導(dǎo)致心腦血管疾病蔓延和惡化的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[21]。血清TC、TG、LDL-C濃度等指標(biāo)中一種以上超過正常最高限值，而HDL-C濃度低于正常最低限值是高脂血癥的具體表現(xiàn)。因此，使血清TC、TG及LDL-C濃度降低或HDL-C濃度升高均可使高脂血癥得到一定程度的改善。本研究結(jié)果表明，給予TOAWA干預(yù)能夠使實(shí)驗(yàn)大鼠血清TC、TG、LDL-C濃度降低和HDL-C濃度升高，呈現(xiàn)良好的降血脂作用。

PPAR-α作為重要的脂類代謝調(diào)控因子，主要分布在肝臟中，其能夠促進(jìn)脂肪酸從血漿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上釋放并被細(xì)胞吸收[22-23]，增加了脂肪酸的利用率，減少了TG的合成。肝臟中PPAR-α基因表達(dá)的上調(diào)可使肝臟對(duì)脂質(zhì)的代謝能力增強(qiáng)，使TG濃度顯著降低，同時(shí)，其能夠增加肝臟脂肪酸的氧化，進(jìn)一步減少TG的合成和分泌，從而降低血脂濃度[24-26]。LDL-R是體內(nèi)清除膽固醇的主要途徑，肝細(xì)胞中的LDL-R在血脂代謝，特別是膽固醇代謝過程中發(fā)揮重要作用，而LDL-R的數(shù)量和活性在分子水平受基因表達(dá)的調(diào)控[27]，高脂飲食可抑制肝臟LDL-R基因轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)量降低，從而減少LDL-R的數(shù)量[28]。本研究結(jié)果表明，TOAWA通過上調(diào)肝臟中PPAR-α基因的表達(dá)水平減少TG的合成和分泌，從而降低血清中TG濃度；通過上調(diào)肝臟中LDL-R基因的表達(dá)水平增加肝臟對(duì)膽固醇的降解，從而降低血清TC濃度。

ApoA-I為調(diào)節(jié)HDL-C的主要Apo，能夠清除膽固醇和防止周圍組織脂質(zhì)沉積，參與膽固醇從外周到肝臟的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程，呈現(xiàn)抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[29-30]。肝臟中的TG除可在線粒體、微粒體等部位進(jìn)行氧化供能外，還可以通過組裝至Apo-B中，形成極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein cholesterol，VLDL）分泌入血液，使動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)增加，肝臟VLDL組裝和分泌障礙也可導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生[31-32]。本研究結(jié)果表明，TOAWA通過提高血清ApoA-I的質(zhì)量濃度和ApoA-I/Apo-B使血清中HDL-C濃度升高，增加了膽固醇自外周向肝臟的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和在肝臟中的降解，清除了血清膽固醇，使得血清膽固醇濃度進(jìn)一步降低；通過降低血清Apo-B質(zhì)量濃度，抑制了VLDL組裝和分泌，從而使得LDL-C的合成減少。

綜上所述，TOAWA通過上調(diào)肝臟中PPAR-α和LDL-R基因、提高血清ApoA-I質(zhì)量濃度和ApoA-I/Apo-B、降低Apo-B質(zhì)量濃度以及改善肝功能等多個(gè)途徑發(fā)揮降血脂的作用，使高脂血癥實(shí)驗(yàn)大鼠血清學(xué)指標(biāo)恢復(fù)到接近正常水平。