王 菁，劉 洋，張 紅，王少康*，孫桂菊

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，江蘇 南京 210009）

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指一系列的病理和臨床表現(xiàn)，是由于機(jī)體的靶器官及靶組織對內(nèi)源性和/或外源性胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低或喪失而產(chǎn)生的[1]。IR是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生的初始原因，同時(shí)也是多種慢性代謝性疾病發(fā)病的基礎(chǔ)[2]，因此，防治慢性代謝性疾病的關(guān)鍵之一是改善IR的狀態(tài)[3-4]。同時(shí)，IR的發(fā)生往往還會(huì)升高炎性因子水平[5]。有研究表明，發(fā)生IR的誘導(dǎo)因素是炎癥，炎性因子的聚集可能會(huì)干擾胰島素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[5-7]，但是如何通過干預(yù)炎性因子改善IR的作用和機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究以總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）[8-9]濃度及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、高敏C反應(yīng)蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）以及白介素-6（interleukin-6，IL-6）含量為評價(jià)指標(biāo)，采用中國野生菰米對高脂膳食誘導(dǎo)的IR模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，探究其對血脂濃度及炎性因子水平的影響，探討我國野生菰米通過降低炎性因子水平從而改善高脂膳食誘導(dǎo)產(chǎn)生的IR作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

5 0 只近交系雄性S P F級S D大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2008-0016。在SPF級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對動(dòng)物進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，將室內(nèi)溫度控制在18～25 ℃，保持相對濕度為50%～70%及干燥、安靜的通風(fēng)環(huán)境，光照周期設(shè)定為12 h。

中國野生菰米（Zizania latifolia）采自江蘇省宿遷市駱馬湖，菰米經(jīng)日光曬干，手工搓去外殼，粉碎過60 目篩制成菰米粉。對照樣品為市售大米和面粉。TC、TG、HDL-C、hs-CRP、IL-6、TNF-α、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）試劑盒 上?；鶢栴D生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems公司；WF130萬能粉碎機(jī)上海魔速科學(xué)器材有限公司；80-2型離心機(jī) 上海醫(yī)療器械廠有限公司；可調(diào)節(jié)移液器 大龍醫(yī)療設(shè)備儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 飼料配方

使用完全配方飼料。以美國營養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的AIN-76M實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合成飼料為陰性對照組飼料，在此基礎(chǔ)上對蛋白質(zhì)和蔗糖的比例進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，增加膽固醇和飽和脂肪酸質(zhì)量，制備成IR模型組飼料（高脂飼料）[10]；同時(shí)用面粉、粳米粉替代高脂飼料中的淀粉和蔗糖，配制成米面組飼料；使用菰米替代高脂飼料中淀粉和蔗糖，配制成高劑量菰米組飼料；使用50%菰米和50%精米、面替代高脂飼料的淀粉和蔗糖，配制成低劑量菰米組飼料[11]。具體配方見表1。

表1 5 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料配方的構(gòu)成Table1 Formulation and composition of five experimental diet

1.3.2 動(dòng)物分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將受試大鼠按照HOMA穩(wěn)態(tài)模型IR指數(shù)（homeostasis model assessment insulin resistance index，HOMA-IR）（按式（1）計(jì)算）進(jìn)行隨機(jī)分組，分別為陰性對照組、高劑量菰米組、低劑量菰米組、米面組及IR模型組，10 只為1 組，分別飼喂與其相對應(yīng)的飼料，實(shí)驗(yàn)周期為8 周。在實(shí)驗(yàn)初期所給予的飼料量低于適應(yīng)性喂養(yǎng)時(shí)10%～20%，每天按時(shí)喂養(yǎng)，單籠飼養(yǎng)。每周稱量并記錄大鼠的體質(zhì)量以及飼料的消耗量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將動(dòng)物禁食不禁水12 h之后處死，麻醉后采用股動(dòng)脈取血，將血清分離（3 000 r/min離心10 min），保存在－20 ℃冰箱內(nèi)，在－80 ℃冰箱中貯存大鼠的小腸及肝臟組織以備用。FBG濃度采用葡萄糖氧化酶法，在2 h內(nèi)測定；FINS水平采用胰島素放射免疫沉淀法，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 檢測指標(biāo)

血脂濃度（TC、TG及HDL-C濃度）的測定：采用Enzymatic-trinder法測定TC濃度（c（TC））；甘油磷酸氧化酶法測定TG濃度（c（TG））；膽固醇氧化酶法測定HDL-C濃度（c（HDL-C）），根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。LDL-C濃度（c（LDL-C））用Friedewald公式（式（2））[12]計(jì)算。

hs-CRP含量的測定采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法；TNF-α含量的測定采用放射免疫分析方法；IL-6含量的測定采用放射免疫分析方法，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 中國野生菰米對大鼠生理情況的影響

實(shí)驗(yàn)過程中，各組動(dòng)物毛色、精神狀況良好，攝食、攝水狀況正常。每只大鼠控制攝食量為20 g/d。在實(shí)驗(yàn)初期，各組大鼠間體質(zhì)量并沒有顯著差異（P＞0.05）。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，各組大鼠的體質(zhì)量均慢慢增長，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)：陰性對照組大鼠的體質(zhì)量顯著低于IR模型組（P＜0.05）；米面組和IR模型組大鼠的體質(zhì)量顯著高于高劑量菰米組和低劑量菰米組（P＜0.05）；高劑量菰米組大鼠體質(zhì)量與陰性對照組無顯著性差異（P＞0.05）；低劑量菰米組大鼠體質(zhì)量高于陰性對照組和高劑量菰米組，但無顯著性差異（P＞0.05）；米面組大鼠體質(zhì)量與IR模型組相比較為接近（表2）。

表2 不同飼料飼養(yǎng)對各組大鼠體質(zhì)量的影響Table2 Effect of different feeds on body mass of rats

2.2 中國野生菰米對大鼠血糖水平和IR的影響

根據(jù)中國野生菰米對高脂膳食誘導(dǎo)大鼠IR機(jī)制的相關(guān)研究可以發(fā)現(xiàn)：在第2周時(shí)，F(xiàn)BG濃度、FINS水平和HOMA-IR均沒有差異，在第4周時(shí)可能產(chǎn)生差異[11]；因此本實(shí)驗(yàn)從第4周時(shí)開始檢測大鼠血糖水平。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，各組大鼠FINS水平以及血清FBG濃度無明顯差異。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢冢琁R模型組血清FBG濃度、FINS水平及HOMA-IR顯著高于陰性對照組（P＜0.05）；與IR模型組和米面組比，低、高劑量菰米組血清FBG濃度和FINS水平、HOMA-IR顯著降低（P＜0.05）；低劑量菰米組血清FBG濃度和FINS水平、HOMA-IR高于高劑量菰米組，但無顯著性差異（P＞0.05）；米面組血清FBG濃度和FINS水平與模型組比無顯著性差異（P＞0.05）（表3～5）。

表3 不同飼料飼養(yǎng)對各組大鼠血清FBG濃度的影響Table3 Effect of different feeds on FBG levels in rats

表4 不同飼料飼養(yǎng)對各組大鼠FINS水平的影響Table4 Effect of different feeds on FINS levels in rats

表5 不同飼料飼養(yǎng)對各組大鼠HOMA-IR的影響Table5 Effect of different feeds on HOMA-IR in rats

2.3 中國野生菰米對大鼠血脂濃度的影響

表6 不同飼料飼養(yǎng)對各組大鼠血脂濃度的影響Table6 Effects of different feeds on blood lipid levels in rats

由表6可知，IR模型組大鼠TG、TC、LDL-C濃度與陰性對照組相比顯著升高，HDL-C濃度顯著降低（P＜0.05）；高、低劑量菰米組TG、TC、LDL-C濃度與IR模型組和米面組相比顯著降低，HDL-C濃度顯著升高（P＜0.05），且與陰性對照組差異不顯著（P＞0.05）；低劑量菰米組TG、TC、LDL-C濃度高于高劑量菰米組，HDL-C濃度低于高劑量菰米組，但是差異不顯著（P＞0.05）；米面組與IR模型組相比血脂濃度接近（P＞0.05）。

2.4 中國野生菰米對大鼠小腸、肝臟組織勻漿炎性因子水平的影響

表7 不同飼料飼養(yǎng)對各組大鼠小腸組織勻漿炎性因子水平的影響Table7 Effect of different feeds on inflammatory factor levels in small intestinal tissue homogenate of IR rats

表8 不同飼料飼養(yǎng)對各組大鼠肝臟組織勻漿炎性因子水平的影響Table8 Effect of different feeds on inflammatory factor levels in liver tissue homogenate of IR rats

從表7、8中可知，與陰性對照組相比，IR模型組和米面組hs-CRP、TNF-α含量顯著升高（P＜0.05），低、高劑量菰米組hs-CRP含量也有所升高，但不顯著（P＞0.05）；與米面組相比，低、高劑量菰米組的hs-CRP、TNF-α含量未見明顯下降，其中高劑量菰米組較低劑量菰米組hs-CRP含量較低，但差異無顯著性（P＞0.05）；與IR模型組相比，高劑量菰米組的TNF-α含量顯著下降（P＜0.05）。與陰性對照組相比，低、高劑量菰米組、IR模型組和米面組IL-6含量顯著升高（P＜0.05）；與IR模型組相比，低、高劑量菰米組的IL-6含量顯著下降（P＜0.05）；與米面組相比，高劑量菰米組IL-6含量顯著下降（P＜0.05），低劑量菰米組IL-6含量有所下降，但不顯著（P＞0.05）。

3 討 論

3.1 高脂膳食誘導(dǎo)IR動(dòng)物模型的建立

本研究在AIN-76M動(dòng)物合成飼料配方的基礎(chǔ)上對蛋白質(zhì)和蔗糖的比例進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整，增加飽和脂肪酸和膽固醇的含量，制成誘導(dǎo)大鼠IR的高脂飼料[13]。在第4周時(shí)，與陰性對照組相比，IR模型組大鼠的血清FBG濃度、FINS水平及HOMA-IR均顯著偏高，這與Efendi?等[14]使用雄性Wistar大鼠建立IR模型的結(jié)果一致。表明IR大鼠模型可以通過高脂膳食的誘導(dǎo)建立。

3.2 中國野生菰米對大鼠血脂濃度的影響

經(jīng)過8 周的造模和膳食干預(yù)，IR模型組大鼠血清TC、TG和LDL-C濃度均顯著高于陰性對照組，HDL-C濃度顯著低于陰性對照組；米面組大鼠血清FBG濃度和血脂濃度與IR模型組接近；與IR模型組和米面組相比，高劑量菰米組大鼠的血清TC、TG和LDL-C濃度均顯著降低，HDL-C濃度顯著升高，且和陰性對照組相當(dāng)；低劑量菰米組大鼠血清TC、TG和LDL-C濃度略高于高劑量菰米組和陰性對照組。

本研究表明，中國野生菰米可以明顯改善高脂膳食誘導(dǎo)的IR大鼠的血糖以及血脂代謝紊亂情況，使得大鼠的血糖濃度和血脂濃度維持在正常的范圍內(nèi)，增強(qiáng)SD大鼠的胰島素敏感性，改善其IR狀態(tài)，但是精米、面并沒有起到預(yù)防、改善的作用。高劑量菰米組效果要略好于低劑量菰米組，但差異無顯著性。說明用菰米替代50%的精米、面就能改善高脂膳食誘導(dǎo)的大鼠糖、脂代謝異常。

菰米改善糖、脂代謝的原因可能和菰米富含生物活性成分有關(guān)。在中國野生菰米中含有大量的生物活性物質(zhì)，例如抗性淀粉、黃酮、酚類、花色苷、皂苷、植物甾醇、多不飽和脂肪酸、生育酚等[15-17]，通過這些生物活性物質(zhì)之間的協(xié)同或相加作用對高脂膳食誘導(dǎo)的IR大鼠胰島素敏感性以及糖、脂代謝水平有所改善[18-19]，在菰米中存在的抗性淀粉的含量比精制的米、面高，平均每100 g菰米中含有11.73 g抗性淀粉，有研究顯示抗性淀粉能夠降低胰島素反應(yīng)及餐后血糖濃度，也能夠改善機(jī)體胰島素敏感性[20]。菰米中的膳食纖維含量是普通米、面的2.4 倍，100 g菰米中總膳食纖維質(zhì)量為7.24 g[20-21]，這對血脂濃度的降低也有一定作用[22]。此外，菰米中的色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，屬于花色苷類化合物，此類物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)血脂代謝，提高機(jī)體的抗氧化能力，從而可能改善脂代謝紊亂的情況。這些都體現(xiàn)出我國野生菰米具有重要的營養(yǎng)保健價(jià)值，但其具體的生物活性物質(zhì)以及相關(guān)的機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。

3.3 中國野生菰米對大鼠炎性因子的影響

近些年來，有相關(guān)研究及流行病學(xué)資料證實(shí)，IR與炎癥之間應(yīng)該存在著相關(guān)性，由此可以推斷出炎癥可能是使得IR發(fā)生的一個(gè)重要因素[23]，而炎性因子干擾胰島素受體底物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則是導(dǎo)致IR發(fā)生的主要分子機(jī)制[5-6]。有研究證實(shí)，肥胖、IR以及代謝紊亂都是一種低度炎癥的狀態(tài)；“系統(tǒng)性炎癥”或者是“慢性低水平的炎癥”就是指代謝性疾病的炎癥狀態(tài)，其被認(rèn)為是由于營養(yǎng)過剩而誘發(fā)的一種長期的炎性反應(yīng)。目前的研究顯示，代謝綜合征人群血漿中炎性因子水平明顯升高，例如在高血脂、高血壓、2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化及肥胖患者的血漿中，IL-6和TNF-α水平都有明顯的升高[23-24]，TNF-α表達(dá)水平在肥胖模型動(dòng)物的血漿里也有明顯的升高[25]，這些結(jié)果都說明炎性因子參與了IR的形成[26]。已有大量證據(jù)證明TNF-α參與了IR的形成，在IR的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[27]。由肝臟分泌產(chǎn)生的重要防御分子hs-CRP，同時(shí)也是全身炎癥反應(yīng)的敏感性標(biāo)志物[28]。hs-CRP通過介導(dǎo)促炎因子IL-1、IL-6的產(chǎn)生從而引起IR；其也可通過促進(jìn)TNF-α的釋放從而抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致IR的形成[26]。

本研究中，IR模型組大鼠小腸TNF-α、hs-CRP和IL-6含量均顯著高于陰性對照組，說明在IR狀態(tài)下，小腸存在炎性狀態(tài)，將進(jìn)一步誘導(dǎo)小腸產(chǎn)生IR；米面組雖然略低于IR模型組，但沒有顯著性差異（P＞0.05），說明米、面不能改善IR狀態(tài)下小腸低度炎性水平。菰米對降低這些炎性因子水平有一定的作用，其可以使脂肪組織所分泌產(chǎn)生的炎性因子TNF-α含量減少，使hs-CRP的合成受到抑制，從而使小腸低度的炎癥狀態(tài)得到緩解。菰米可以通過減少脂肪的蓄積降低體質(zhì)量，從而減少炎性因子的分泌，同時(shí)還可能通過升高HDL-C濃度以及降低TG、TC、LDL-C濃度使內(nèi)皮損傷減輕，從而進(jìn)一步使慢性炎癥的狀態(tài)得到減輕。因此，炎癥機(jī)制可能成為IR發(fā)生機(jī)制中的一個(gè)重要的研究方向，但如何有效地對炎性因子進(jìn)行干預(yù)從而改善IR仍有待研究。

綜上，中國野生菰米可以通過降低血糖濃度、調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂情況，從而使高脂膳食誘導(dǎo)的大鼠IR作用得到改善。同時(shí)，其可以通過調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)、緩解機(jī)體的炎癥狀態(tài)，從而改善高脂膳食誘導(dǎo)大鼠的IR作用。