王 英，夏秀東，董 月，劉小莉，周劍忠*

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

氧化應(yīng)激是生物體內(nèi)的活性氧/氮的產(chǎn)生數(shù)量超過體內(nèi)抗氧化保護機制清除活性氧/氮數(shù)量的一種狀態(tài)[1]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下形成的活性氧（reactive oxygen species，ROS）如超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫，能針對性地破壞生物膜脂質(zhì)磷脂中的不飽和脂肪酸，導致細胞的系列過氧化反應(yīng)，形成的氧化產(chǎn)物進一步作用于細胞的核酸和蛋白質(zhì)，破壞細胞的正常功能，從而產(chǎn)生不同程度的氧化損傷[2-7]。目前研究結(jié)果顯示，與氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病涉及到機體系統(tǒng)的各個方面，包括阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、哮喘、過敏、糖尿病等疾病，另外還有些高血壓、高血脂、冠心病和癌癥等都與氧化損傷有著十分密切的關(guān)系[8-10]。

大量關(guān)于乳酸菌體內(nèi)、外的抗氧化功能研究結(jié)果顯示，乳酸菌細胞和無細胞提取物在體外具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、螯合金屬離子等活性[11-17]。體內(nèi)攝入乳酸菌對機體或細胞的氧化應(yīng)激具有顯著的調(diào)節(jié)作用，能提高體內(nèi)抗氧化相關(guān)功能基因的表達并降低體內(nèi)過氧化產(chǎn)物的活力[18-20]。

目前，乳酸菌抗氧化功能一般都是通過體外篩選獲得，通過體外相關(guān)抗氧化指標的測定篩選乳酸菌[21-23]。但是體外篩選的環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境相差很大，已有很多學者對此提出異議，認為乳酸菌緩解氧化應(yīng)激能力必須通過體內(nèi)模型的驗證才有研究意義和應(yīng)用價值。目前比較常用的一種小鼠氧化損傷模型是D-半乳糖長期給藥造成小鼠衰老的模型，這個模型比較接近小鼠自然衰老，表現(xiàn)出小鼠壽命縮短、體內(nèi)氧化壓力上升等，可以用來觀察藥物的抗氧化作用。

副干酪乳桿菌FM-M9-1來源于傳統(tǒng)自然發(fā)酵食品，是具有優(yōu)良的體外抗氧化能力的乳酸菌[24]。本研究以D-半乳糖誘導的氧化應(yīng)激損傷模型小鼠為研究對象，研究飼喂副干酪乳桿菌FM-M9-1對氧化應(yīng)激的體內(nèi)干預(yù)和緩解作用，進而揭示緩解氧化損傷的機制，為開發(fā)針對氧化還原失衡和氧化應(yīng)激損傷的功能性產(chǎn)品提供可靠的、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的乳酸菌菌株資源。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

實驗動物采用SPF級昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由揚州大學動物中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2012-0004。實驗動物普通飼料由青龍山飼料物廠提供。

副干酪乳桿菌FM-M9-1由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室保存。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽與谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所；TRIzol總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒 大連寶生物科技公司；引物由上海生物工程有限公司合成，其他常規(guī)試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI7500Fast實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；UV-1600PC紫外分光光度計 上海美普達科技有限公司；YQX-11厭氧培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；3K15臺式冷凍離心機德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠飼養(yǎng)

小鼠適應(yīng)一周后，稱體質(zhì)量，然后隨機分成5 組，每組10 只。將小鼠同室分籠喂養(yǎng)，采用自然光照，自由采食和飲水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（25±2）℃，相對濕度60%，實驗周期為60 d。

1.3.2 菌株FM-M9-1培養(yǎng)及菌體處理

挑取FM-M9-1單菌落至MRS液體試管中，37 ℃靜止培養(yǎng)18～20 h至穩(wěn)定初期，以此為接種液，按體積分數(shù)3%的接種量轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，上述培養(yǎng)好的菌液5 000 r/min離心5 min收集菌體，用生理鹽水洗2 次后重懸菌體，調(diào)整菌體濃度分別為（5.01±0.05）×108CFU/mL和（5.01±0.05）×1010CFU/mL，備用。

1.3.3 小鼠分組

對照組：頸背部皮下每天注射200 mg/（kg·d）生理鹽水，灌胃0.2 mL生理鹽水；模型組、實驗組和VC組頸背部皮下每天注射D-半乳糖（200 mg/（kg·d））。其中，模型組灌胃0.2 mL生理鹽水；實驗組中，低劑量組灌胃0.2 mL菌體濃度為（5.01±0.05）×108CFU/mL的FM-M9-1菌液；高劑量組灌胃0.2 mL菌體濃度為（5.01±0.05）×1010CFU/mL的FM-M9-1菌液；VC組灌胃200 mg/（kg·d） VC。

1.3.4 小鼠肝臟和腎組織樣品的處理

實驗結(jié)束后，將小鼠禁食12～18 h，斷頸處死，迅速取出肝臟和腎臟，置于冰冷生理鹽水中漂洗拭干，稱質(zhì)量，制備腎臟和肝組織勻漿液用于氧化應(yīng)激標志物的測定和分析。

肝組織勻漿的制備：每只取出小鼠肝組織總質(zhì)量的10%，加入9 倍組織質(zhì)量的預(yù)冷生理鹽水，充分研磨勻漿，3 000 r/min離心15 min，棄沉淀，所得上清液即為肝勻漿液，備用。腎組織勻漿的制備同肝組織。

肝、腎組織勻漿液中蛋白質(zhì)量濃度采用考馬斯亮藍法測定，以牛血清白蛋白為標準蛋白質(zhì)，制作標準曲線，得到蛋白質(zhì)量濃度（x/（mg/mL））與OD595nm（y）的回歸方程為y＝0.010 9x+0.081 4（R2＝0.998 6）。

1.3.5 氧化應(yīng)激標志物的檢測與分析

利用試劑盒測定小鼠肝和腎臟組織中的GSH-Px、SOD活力以及蛋白質(zhì)羰基、MDA含量。

1.3.6 qPCR法檢測Sod、Gsh-Px、Nrf2和Trx基因的相對表達水平

用TRIzol試劑提取各實驗組小鼠肝和腎臟組織的RNA，超微量核酸分析儀測定濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR Select Mast Mix：ABI配制10 μL反應(yīng)體系，采用ABI7500Fast qPCR檢測Sod、Gsh-Px、Nrf2和Trx基因的表達水平，引物序列如表1所示。以β-actin為內(nèi)參基因，Ct值通過熒光定量儀的分析軟件給出，最后基因的表達水平用2－△Ct表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和整理，采用SPSS 15.0和One-way ANOVA軟件進行統(tǒng)計和顯著性分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織GSH-Px活力的影響

蛋白質(zhì)羰基和MDA含量、SOD、GSH-Px活力是反映機體氧化應(yīng)激活力的4 個常見標志物。已有研究結(jié)果顯示，乳酸菌處理氧化損傷小鼠，能不同程度地提高小鼠機體組織中SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活力，同時降低蛋白質(zhì)羰基化和MDA含量。Wang Yuzhen等[18]利用Lactobacillus casei Zhang菌株處理內(nèi)毒素和D-半乳糖誘導的氧化損傷小鼠，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus casei Zhang能夠顯著提高小鼠肝臟中的SOD活力，并顯著降低MDA含量。Kamaladevi等[20]利用Lactobacillus casei處理有機磷殺蟲劑誘導氧化損傷的秀麗隱桿線蟲，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus casei能夠顯著提高線蟲的過氧化氫酶、SOD、GSH-Px、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等相關(guān)抗氧化酶的活力，進而緩解氧化損傷。Zhang Li等[25]利用Lactobacillus plantarum C88處理過氧化氫誘導的氧化損傷Caco-2細胞，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus plantarum C88能夠顯著降低MDA含量，顯著提高細胞的SOD和總抗氧化酶活力，并呈現(xiàn)量效關(guān)系。

表2 不同處理對小鼠肝、腎GSH-Px活力的影響Table2 Effects of different treatment on GSH-Px activity in liver and kidney of mice

從表2可以看出，與對照組相比，模型組小鼠的腎臟、肝臟GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），表明D-半乳糖誘導的小鼠氧化損傷模型比較成功。與模型組相比，低、高劑量組均能不同程度地提高肝臟和腎臟組織中GSH-Px活力，但是低劑量組差異不顯著。

2.2 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織SOD活力的影響

在機體內(nèi)，SOD具有清除超氧陰離子自由基的功能，保護細胞免受超氧陰離子自由基造成的損傷，在氧化還原平衡與氧化應(yīng)激酶調(diào)節(jié)機制中扮演著重要角色。

表3 不同處理對小鼠肝、腎SOD活力的影響Table3 Effect of different treatments on SOD activity in liver and kidney of mice

由表3可知，與模型組相比，低、高劑量FM-M9-1均能不同程度地提高肝臟和腎臟組織中SOD活力，但是低劑量組小鼠的肝臟和腎臟組織中SOD活力升高不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織蛋白質(zhì)羰基含量的影響

表4 不同處理對小鼠肝、腎蛋白質(zhì)羰基含量的影響Table4 Effects of different treatments on protein carbonyl content in liver and kidney of mice

由表4可知，與對照組相比，模型組小鼠的腎臟和肝臟組織中蛋白質(zhì)羰基的含量都顯著升高（P＜0.01或P＜0.001），表明D-半乳糖誘導的小鼠氧化損傷模型比較成功。與模型組相比，不同劑量組均能不同程度地下調(diào)肝臟和腎臟組織中蛋白質(zhì)羰基含量，低劑量組的小鼠的肝和腎中蛋白質(zhì)羰基含量下降不顯著（P＞0.05）。

2.4 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織MDA含量的影響

MDA含量是反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的一項生物標志物，可以間接反映機體和細胞受ROS與自由基攻擊的氧化應(yīng)激程度。

表5 不同處理對小鼠肝、腎MDA含量的影響Table5 Effects of different treatments on MDA content in liver and kidney of mice

由表5可知，與模型組相比，低、高劑量組均能不同程度地下調(diào)肝臟和腎臟組織中MDA含量，低劑量組小鼠腎臟組織的MDA含量與模型組相比差異不顯著（P＞0.05），肝臟組織中的MDA含量與模型組相比顯著降低（P＜0.05）。

2.5 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織中Sod基因表達水平的影響

圖1 不同處理小鼠腎臟和肝臟中Sod基因表達量Fig.1 Sod mRNA expression in kidney and liver of mice with different treatments

如圖1A所示，與對照組相比，模型組小鼠腎組織Sod基因表達水平極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，VC組和高劑量組Sod基因表達水平極顯著提高（P＜0.01或P＜0.001），低劑量FM-M9-1能夠顯著提高Sod基因的表達水平（P＜0.05）。圖1B顯示，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中的Sod基因表達水平極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，不同劑量乳酸菌和VC處理都能不同程度地提高Sod基因的表達水平。

2.6 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織中Gsh-Px基因表達水平的影響

GSH-Px是機體抗過氧化屏障的重要組分，其表達水平的高低與機體對過氧化損傷的修復有密切關(guān)系。

圖2 不同處理小鼠的腎組織和肝組織中Gsh-Px基因的表達水平Fig. 2Gsh-Px mRNA expression in kidney and liver of mice with different treatments

由圖2可知，與對照組相比，模型組小鼠腎和肝組織中的Gsh-Px基因表達水平高度顯著降低（P＜0.001）。與模型組相比，高劑量乳酸菌和VC處理都能不同程度地提高Gsh-Px基因的表達水平，低劑量組變化不顯著。

2.7 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織中Nrf2基因表達水平的影響

核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2）是氧化應(yīng)激的防御機制之一，它調(diào)節(jié)并激活細胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中和活性氧、促進細胞存活、保持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)定[26]。Zhou Ningna等[27]利用來源于Panax notoginseng的皂素處理損傷的SH-SY5Y細胞，發(fā)現(xiàn)Panax notoginseng的皂素能夠通過上調(diào)Nrf2的表達并增強Nrf2及其下游抗氧化系統(tǒng)活力，主要包括血紅素加氧酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，從而緩解細胞的ROS積累。

圖3 不同處理小鼠的腎組織和肝組織中Nrf2基因的表達水平Fig.3 Nrf2 mRNA expression in kidney and liver of mice with different treatments

由圖3可知，與對照組相比，模型組小鼠腎和肝組織中的Nrf2基因表達水平高度顯著降低（P＜0.001）。與模型組相比，VC和高劑量FM-M9-1能夠極顯著提高肝和腎組織中Nrf2基因的表達水平（P＜0.01或P＜0.001）。低劑量FM-M9-1能夠顯著上調(diào)腎組織Nrf2基因表達水平（P＜0.05），肝組織中Nrf2基因表達水平未顯著上調(diào)（P＞0.05）。

2.8 不同處理對氧化損傷小鼠肝臟和腎組織中Trx基因表達水平的影響

硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）與煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）構(gòu)成的Trx系統(tǒng)是一個廣泛分布于原核生物和真核生物的NADPH依賴的二硫化物還原酶系統(tǒng)，在機體氧化還原平衡及細胞增殖中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[28]，Trx能夠直接清除細胞內(nèi)過氧化氫及氧自由基等ROS，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原平衡[29-30]。Yamada等[31]證實Trx能通過清除ROS保護高氧誘導的肺上皮細胞損傷。Tanaka等[32]在實驗中觀察到Trx缺失的細胞體內(nèi)有ROS增加、凋亡細胞增多以及細胞色素c表達上調(diào)等現(xiàn)象，從而推斷Trx能清除線粒體內(nèi)的ROS并在調(diào)節(jié)線粒體細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮重要作用。

圖4 不同處理的小鼠腎組織和肝組織中Trx基因表達水平Fig.4 Trx mRNA expression in kidney and liver of mice with different treatments

由圖4可知，與對照組相比，模型組小鼠腎和肝組織中Trx基因表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01或P＜0.001）。與模型組相比，高劑量FM-M9-1能夠極顯著上調(diào)Trx基因的表達水平（P＜0.01）；低劑量組腎組織Trx基因表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），但在肝組織中未顯著上調(diào)（P＞0.05）。

3 結(jié) 論

利用D-半乳糖誘導氧化損傷模型小鼠，研究不同劑量的FM-M9-1菌體對氧化損傷小鼠的修復作用，同時以VC作為陽性藥物對照，測定腎和肝組織中SOD、GSH-Px、MDA、蛋白質(zhì)羰基含量，同時利用qPCR方法對小鼠肝臟和腎臟組織的Sod、Gsh-Px、Nrf2和Trx基因的表達水平進行分析，揭示FM-M9-1緩解氧化損傷的作用機制。結(jié)果表明：低、高劑量FM-M9-1均能不同程度地提高小鼠肝和腎組織中的GSH-Px和SOD的活力，降低小鼠肝和腎組織中的蛋白質(zhì)羰基和MDA含量，提高小鼠肝臟和腎臟組織中與抗氧化功能相關(guān)的Sod、Gsh-Px、Nrf2和Trx基因的表達水平。推測FM-M9-1通過上調(diào)小鼠體內(nèi)抗氧化相關(guān)基因Sod、Gsh-Px、Nrf2和Trx的表達，提高抗氧化酶SOD、GSH-Px活力，抑制體內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂肪的氧化損傷，最終達到緩解小鼠氧化損傷的作用。