孔 娜，虞 泓，張艷艷，葛 鋒,3,*

（1.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500；2.云南大學中草藥生物資源研究所云百草實驗室，云南 昆明 650091；3.昆明市蟲草生物資源開發(fā)利用工程技術研究中心，云南 昆明 650091）

疲勞是身體在高強度或長時間活動后，產(chǎn)生的一種生理或心理現(xiàn)象，表現(xiàn)為身體困倦、精神倦怠、注意力減退、工作效率下降，經(jīng)常處于疲勞狀態(tài)就會發(fā)展為病理性損害。通過有針對性的補充外源營養(yǎng)補劑或藥物來緩解疲勞的發(fā)生，是解決疲勞的有效方法。因此在天然產(chǎn)物中尋找、篩選具有抗疲勞作用的有效成分、探究其作用機制具有重要現(xiàn)實意義[1-4]。

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）是名貴中藥材，其生物活性物質(zhì)包括多糖、核苷、麥角固醇和甘露醇等。冬蟲夏草具有補腎益肺、抗炎、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[5]。蘭坪蟲草（Ophiocordyceps lanpingensis，OL）是一種寄生在鉤蝠蛾幼蟲上的蟲草真菌，主要分布于我國滇西北地區(qū)，是近幾年發(fā)現(xiàn)的線蟲草屬新種[6]。OL與冬蟲夏草親緣關系較近，富含蟲草多糖、核苷類、甾醇類、氨基酸等多種活性物質(zhì)，其主要成分在種類與含量方面與冬蟲夏草相似，且易人工培養(yǎng)，具有替代冬蟲夏草入藥的潛力，研究開發(fā)OL具有重要的理論研究和實際應用價值[6]。目前，本實驗室已實現(xiàn)OL的規(guī)模化培養(yǎng)[7]，為深入開展人工培養(yǎng)OL的活性成分以及功能研究提供了支撐。本實驗依照《保健食品檢測與評價技術規(guī)范》中有關抗疲勞功能的測定方案[8]，研究了OL菌粉的抗疲勞作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性昆明鼠，質(zhì)量18～22 g，購于遼寧長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK（遼）2010-0001。

OL菌粉 云南云百草生物技術有限公司；西洋參云南向輝藥業(yè)有限公司；0.5%羧甲基纖維素鈉溶液生工生物工程股份有限公司。

血清尿素氮（blood uria nitrogen，BUN）測定試劑盒、血乳酸（blood lactic acid，BLA）測定試劑盒、乳酸脫氫酶測定試劑盒、肌酸激酶測定試劑盒、蒽酮試劑南京建成生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

Auegra x-22R高速低溫離心機、LH750血液分析儀美國貝克曼庫爾特有限公司；Ultrospec 2100pro紫外分光光度計 美國GE公司；XO-SM100超聲微波組合反應裝置 南京先歐儀器制造有限公司；HH-4水浴鍋常州智博瑞儀器制造有限公司；DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 OL有效成分的檢測

OL菌粉D-甘露醇含量測定參照文獻[9]：采用水提回流離心的方法，提取分離OL菌粉D-甘露糖，用高碘酸鈉與甘露醇反應產(chǎn)生黃色物質(zhì)，在412 nm波長處測定其最大OD值。甘露醇質(zhì)量濃度在10～50 mg/L之間時，與OD412nm有良好的線性關系，以OD412nm為縱坐標，D-甘露醇質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y＝0.010 2X－0.003 1，R2＝0.999 6；多糖含量采用苯酚-硫酸法[9-10]測定：以葡萄糖為對照品，取供試品溶液0.2 mL至具塞試管中，加入1 mL體積分數(shù)6%重蒸苯酚、5 mL濃硫酸，混勻，室溫放置10 min，40 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，搖勻，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度Y為縱坐標，葡聚糖質(zhì)量X為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y＝0.011 5X－0.003 8，R2＝0.999 5，用上述方法測定樣品中多糖含量；黃酮含量采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH顯色法[11]測定：分別加入蘆丁標準溶液1、2、3、4、5 mL于5 支15 mL的刻度試管中，然后加入0.3 mL質(zhì)量分數(shù)0.5%的NaNO2，靜置6 min。加入4 mL NaOH溶液，最后用蒸餾水定容至10 mL，在室溫條件下反應15 min后，于510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，黃酮濃度為橫坐標繪制標準曲線，建立回歸方程Y＝0.001 2X－0.009 8，R2＝0.999 6，用上述方法測定樣品黃酮含量；腺苷含量通過建立高效液相色譜法[12]測定：采用ACCLAIM C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相甲醇-水（體積比15∶85）；流速1.0 mL/min；紫外檢測波長260 nm，制備標準液注入液相色譜儀中，以進樣量為縱坐標，峰面積為橫坐標繪制腺苷標準曲線：Y＝0.021X。制備樣品溶液注入高相液相色譜儀中，測定腺苷濃度。

1.3.2 動物分組與灌胃

實驗小鼠飼養(yǎng)條件：溫度18～22 ℃、相對濕度50%～55%，自然光照，自由飲水。小鼠給予基礎飼料飼養(yǎng)一周，小鼠隨機分為5 個實驗組，每組10 只，分別為OL低劑量組（OLL組，OL灌胃劑量450 mg/（kg·d））、中劑量組（OLM組，OL灌胃劑量900 mg/（kg·d））、高劑量組（OLH組，OL灌胃劑量1 800 mg/（kg·d））以及空白對照組（BC組，灌胃蒸餾水900 mg/（kg·d））、陽性對照組（AG組，西洋參灌胃劑量600 mg/（kg·d）），每周稱體質(zhì)量一次，根據(jù)小鼠體質(zhì)量給予不同劑量的受試物，連續(xù)灌胃30 d。稱取10 g OL菌粉溶于100 mL質(zhì)量分數(shù)0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，4 ℃冰箱保存。連續(xù)灌胃30 d。給藥期間記錄小鼠初始體質(zhì)量和終末體質(zhì)量，并每周記錄小鼠的攝食量。

1.3.3 負重游泳實驗

小鼠負重游泳實驗末次給予受試藥物30 min后，將鼠尾根部負荷其體質(zhì)量5%的鉛皮，置小鼠于游泳箱（50 cm×50 cm×40 cm）中游泳，水深30 cm，水溫25 ℃，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間（小鼠鼻孔10 s內(nèi)不能浮出水面），即小鼠負重游泳時間。

1.3.4 BUN濃度、乳酸脫氫酶等指標的測定

小鼠末次給予受試藥物30 min后，將小鼠放于游泳箱中不負重游泳90 min，休息60 min后小鼠摘眼球取血，置于4 ℃冰箱約3 h。血液凝固后，血液樣品以3 000 r/min離心10 min分離血清，取血清備用。用試劑盒測定BUN濃度，乳酸脫氫酶、肌酸激酶活力及血糖濃度。

馬太太笑道：“易先生你太太不像你說話不算話，上次贏了不是答應請客，到現(xiàn)在還是空頭支票，好意思的？想吃你一頓真不容易?！?/p>

1.3.5 BLA濃度的測定

小鼠末次給予受試藥物30 min后，將小鼠放于游泳箱中不負重游泳10 min，水溫（30±1）℃，并于游泳前、后立即休息20 min，然后用毛細管眼球內(nèi)眥部取血20 μL。用乳酸試劑盒測定BLA濃度，并計算BLA曲線下面積，即BLA曲線下面積＝5×（游泳之前BLA濃度+3×游泳后0 min的BLA濃度+2×游泳后休息20 min后的BLA濃度）。

1.3.6 肝和血漿中抗氧化參數(shù)的檢測

將1.3.4節(jié)小鼠脫頸椎處死，摘眼球取血（加抗凝劑），用于血液生化指標檢測。取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后濾紙吸干，取組織塊用冰冷的生理鹽水勻漿制備體積分數(shù)10%組織勻漿，利用抗氧化酶試劑盒測定抗氧化酶活力。

1.3.7 LG含量測定及血液參數(shù)指標的檢測

小鼠肝糖原（liver glycogen，LG）的含量利用蒽酮試劑測定。末次給予受試物30 min后脫頸椎處死，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后濾紙吸干，精確稱取肝臟0.1 g于離心管中，加入質(zhì)量分數(shù)5%三氯醋酸8 mL，每管勻漿1 min，勻漿離心得上清液，取上清液1 mL，然后加入體積分數(shù)95%的乙醇溶液4 mL，室溫下豎立放置過夜。沉淀完全后，3 000 r/min離心15 min獲得沉淀物，加入2 mL蒸餾水溶解沉淀物，再加入蒽酮試劑，在所有離心管達到室溫后，將其浸入沸水浴15 min后，然后移入冷水浴。將離心管內(nèi)液體移入比色管，使用分光光度計在620 nm波長處檢測吸光度。計算糖原含量并進行統(tǒng)計分析；脫頸椎處死時取血加抗凝劑利用LH750血液分析儀檢測血液參數(shù)指標。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析采用Excel和SPSS 20.0軟件，各組間數(shù)據(jù)采用方差分析，按方差程序先進行方差齊性分析檢驗，方差齊用Duncan方法計算F值比較各組間的差異性，方差不齊用Dunnett’s T3及非參數(shù)檢驗統(tǒng)計學處理比較各組間的差異有無顯著性，P＜0.05認為差異顯著，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 OL對小鼠體質(zhì)量和攝食量的影響

表1 OL對小鼠體質(zhì)量的影響（n＝10）Table1 Effect of OL on body mass of mice (n= 10)g

表2 OL對小鼠攝食量的影響（n＝10）Table2 Effect of OL on food intake of mice (n= 10)g

2.2 OL有效成分含量

通過測定，發(fā)現(xiàn)OL的D-甘露醇、黃酮、多糖和腺苷含量分別為（25.65±10.42）、（0.98±0.20）、（46.46±19.76）mg/g和（451.61±125.42）μg/g。已有研究表明，黃酮具有自由基抑制活性，能增加機體的抗疲勞能力[13]，多糖是一種廣泛存在于天然產(chǎn)物中的大分子物質(zhì)，具有廣泛的藥理學活性[14]，并具有增強機體抗疲勞的能力[15]。

2.3 OL對小鼠負重游泳時間的影響

圖1 OL對小鼠負重游泳時間的影響（n＝10）Fig.1 Effect of OL on weight-loading swimming time of mice (n = 10)

運動耐力的提高是抗疲勞能力加強最有力的宏觀表現(xiàn)，游泳時間的長短可以反映動物的疲勞程度。如圖1所示，OLL、OLM、OLH組和AG組負重游泳時間與對照組比較明顯延長（P＜0.05），分別延長了47.4%、70.5%、71.7%和68.0%。說明OL能延長小鼠游泳時間，提高小鼠運動耐力，延緩疲勞發(fā)生。

2.4 OL對小鼠相關疲勞生化指標的影響

疲勞產(chǎn)生的重要原因是能源物質(zhì)的消耗和代謝物質(zhì)的積累[16]。常用的疲勞評價方法主要有兩個：運動耐力實驗和生化指標檢測。在反映疲勞的生化指標中，BUN濃度、BLA濃度、LG含量等的改變具有代表性，也是檢測疲勞最常用的指標[17]。BUN作為蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝產(chǎn)物，是評定機體對運動適應能力的重要指標之一，當機體長時間活動不能通過糖和脂肪分解代謝得到足夠的能量時，機體蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝隨之增強，血清BUN濃度隨運動負荷的增加而增加。

圖2 OL對小鼠血液生化指標的影響（n＝10）Fig.2 Effect of OL on blood biochemical indices of mice (n = 10)

由圖2A可知，OLM組和OLH組BUN濃度與BC組相比顯著降低（P＜0.05），說明OL能減緩劇烈運動中蛋白質(zhì)的過量分解，提高機體對劇烈運動的適應能力[18]。LG是重要的能源物質(zhì)，機體血糖濃度降低時可迅速分解釋放入血液中，以維持血糖水平的穩(wěn)定[19]。實驗結(jié)果表明，OLH組和AG組LG含量與BC組相比顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），說明OL能為機體提供能量來達到抗疲勞的目的。乳酸脫氫酶通常存在于肌細胞中并能釋放入血液中，乳酸脫氫酶氧化釋放乳酸并改變pH值，導致肌肉損傷。因此，乳酸脫氫酶可以作為檢測疲勞的指標[20]。BLA是碳水化合物在厭氧條件下糖酵解的產(chǎn)物，持續(xù)運動會導致過量BLA的生成和積累，誘導身體產(chǎn)生疲勞。BLA的積累會導致血液pH值降低，危害各種器官進而導致疲勞[22]。如圖2B所示，OLM、OLH、AG組乳酸脫氫酶活力顯著低于BC組（P＜0.05），能有效抑制運動后BLA的產(chǎn)生，增強小鼠運動耐力。說明適量OL能夠調(diào)控BLA和乳酸脫氫酶的水平。血清肌酸激酶活力是評價骨骼肌損傷的一個重要指標，過度運動會對肌組織造成一定的損傷，導致肌酸激酶活力升高[21]。如圖2C所示，OL能夠顯著降低游泳小鼠肌酸激酶活力（P＜0.05）。

表3 OL對小鼠血液乳酸的影響（n＝10）Table3 Effect of OL on blood lactic acid level of mice (n= 10)

如表3所示，OLM、OLH、AG組與BC組比較，小鼠運動前后BLA濃度顯著降低（P＜0.05）。OLL組也能一定程度上降低小鼠體內(nèi)BLA濃度，但與BC組相比，無顯著性差異。說明適當劑量的OL具有抑制運動過程中BLA濃度升高的作用，對緩解疲勞有一定幫助。

2.5 OL對小鼠肝臟和血液氧化應激參數(shù)的影響

劇烈運動過程中，能量高消耗會引起氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的失衡，導致活性氧的增加和抗氧化劑的減少，骨骼肌活性氧過剩，最終引起外周疲勞[23-25]。人吸氧量的2%～3%經(jīng)過新陳代謝會轉(zhuǎn)化為氧自由基。一方面，氧自由基作為信號分子，參與正常的生理過程；另一方面，過量的氧自由基能引起氧化應激、細胞損傷和肌肉疲勞[26]。為維持體內(nèi)平衡，過量的氧自由基需要抗氧化劑清除，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）是重要的清除自由基和代謝產(chǎn)物的抗氧化酶。SOD對機體的氧化和抗氧化平衡起著至關重要的作用，它能清除超氧陰離子自由基以保護細胞免受損傷[27]。

由表4可知，在肝臟中，AG組SOD活力極顯著高于BC組（P＜0.01），OL各劑量組SOD活力顯著高于BC組（P＜0.05）；OLM和AG組能顯著提高CAT活力（P＜0.05）。同時，在血液中，OL各劑量組均能顯著提高SOD活力（P＜0.05），OLL組和OLM組能顯著提高CAT活力（P＜0.05）。說明OL有可能通過提高機體SOD和CAT活力，增加抗氧化能力，進而減少自由基的積累，加速體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的及時清除，增強小鼠運動耐力和抗疲勞作用。

表4 OL對小鼠肝臟和血液抗氧化指標的影響（n＝10）Table4 Effect of OL on liver and blood antioxidant indices of mice (n= 10)

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是評估細胞氧化應激的重要指標。機體在代謝過程中產(chǎn)生自由基，自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物。通過測定MDA含量可以反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，間接表明細胞損傷的程度[28]。肝臟中，OLM組和OLH組MDA含量極顯著低于BC組（P＜0.01），AG組MDA含量與BC組比較也有顯著性差異（P＜0.05）。血液中，OLM組MDA濃度與BC組比較也有顯著性差異（P＜0.05）。以上研究結(jié)果表明，OL可以減弱運動過程中的細胞氧化應激反應，降低脂質(zhì)過氧化程度，維持細胞正常生理功能，從而體現(xiàn)抗疲勞作用。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）催化過氧化氫分解的關鍵酶，廣泛存在于機體組織中。它特異性催化GSH對過氧化氫的反應，起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[29]。AG組GSH-Px活力顯著高于BC組（P＜0.01），OLL、OLM組GSH-Px活力與BC組比較也有顯著性差異（P＜0.05）。本研究中，OL劑量組的CAT、SOD和GSH-Px活力與BC組相比，均有導致生理效應趨好的效果。此結(jié)果與冬蟲夏草相關報道一致，冬蟲夏草具有抑制MDA生成，清除氧自由基、羥基自由基和超氧化物陰離子的作用[30]?？寡趸富盍Φ奶岣吣軌蚓徑膺\動疲勞[31]。綜合上述結(jié)果，可以認為OL具有較好的抗氧化作用，而口服抗氧化劑已經(jīng)被證明能夠降低氧化應激反應，緩解肌肉疲勞，提高運動能力[32]。因此，OL抗氧化作用可能是其具有抗疲勞功效的機理之一。

2.6 OL對小鼠血液參數(shù)的影響

血紅蛋白作為疲勞恢復程度的重要指標，是紅細胞的主要成分，主要功能是運輸氧氣和二氧化碳，保證機體氧氣供應充足，進而促進機體有氧代謝，提高運動耐力。研究表明運動可以誘發(fā)血液單核細胞的變化，如淋巴細胞、單核細胞、白細胞[33]。

表5 OL對小鼠血液相關指標的影響（n＝10）Table5 Effect of OL on fatigue-related blood indices of mice (n= 10)

由表5可知，與BC組相比，OL各劑量組血紅蛋白質(zhì)量濃度和紅細胞濃度均有所提高，OLL、AG組血紅蛋白質(zhì)量濃度極顯著升高（P＜0.01）。AG組白細胞和淋巴細胞濃度極顯著高于BC組（P＜0.01），OLM組白細胞和淋巴細胞濃度與BC組比較也顯著升高（P＜0.05）。研究表明OL能維持或增加血紅蛋白和紅細胞濃度，保證機體氧氣供應充足，提高有氧代謝能力，緩解疲勞。

3 結(jié) 論

OL能夠通過增加機體肝糖原儲備，減少BUN、BLA等代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累，提高機體SOD、GSH-Px、CAT活力，加強對自由基的清除，增加血液紅細胞、血紅蛋白含量來增加氧氣和二氧化碳的運輸效率，緩解運動疲勞。而且其功效與已有的具備明確改善機體抗疲勞藥效的藥物相似。本研究為充分利用OL，將OL開發(fā)為抗疲勞的運動營養(yǎng)劑提供了參考。