閔佳玲，許春蓮，舒 翔，邱奇琦，聶少平，謝明勇，胡曉鵑,2,*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，江西 南昌 330006）

植物雌激素是一大類植物源性的天然化合物，廣泛存在于人類的日常食材當中[1]。由于它們的結構與哺乳動物體內的雌激素結構類似，在人體內可激活相應的受體以發(fā)揮雌激素類生物學效應[2]。目前研究表明，植物雌激素從本質上是一種內分泌干擾物，其不當攝入極有可能打破原有的生殖內分泌平衡狀態(tài)，從而引發(fā)相關的負面效應[3]。研究其對于人群健康的影響，尤其是對于內源性雌激素水平較低且肝臟生物轉化能力較弱的未成年個體的影響，具有非常重要的現(xiàn)實意義。

槲皮素屬于植物雌激素中的黃酮類物質，以多種β-糖苷的形式存在于許多日常食用蔬菜及水果中，其人群攝入平均水平較高（每日攝入量為10～20 mg）[4]。因此，日常膳食所引發(fā)的槲皮素攝入對于人體健康的影響日益為人們所關注。

乳腺組織作為典型的雌激素敏感性組織，其發(fā)育過程自然極可能會受到激素樣物質不當攝入的負面影響[3,5]。本研究中，以21 日齡雌性小鼠為模型，考察長期膳食水平槲皮素攝入對于其乳腺組織發(fā)育的影響，期望能從整體動物水平客觀評價槲皮素長期攝入對于圍青春期乳腺發(fā)育過程的潛在影響，為相關食品安全預警提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級2 1 日齡雌性昆明小鼠3 6 只（體質量10～13 g；許可證號：SCXK（湘）2016-0002），購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

小鼠飼料（不含植物雌激素） 北京實驗動物飼料公司；槲皮素（純度＞99%）、異鼠李素（純度＞99%）；葡聚糖凝膠、胰脂肪酶、葡萄糖醛酸酶、硫酸酯酶 美國Sigma-Aldrich公司；雌激素受體（estrogen receptor，ER）α及ERβ一抗、孕激素受體（progesterone receptor，PR）一抗、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）一抗 美國Abcam公司；山羊抗兔過氧化物酶標記染色試劑盒、辣根過氧化物酶（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒、蘇木精北京中杉金橋生物技術有限公司；甲醇、乙腈、甲酸、二甲基亞砜、乙酸銨、乙酸乙酯、正己烷、氯仿 上海振興化工一廠。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜四極桿飛行時間串聯(lián)質譜（high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight/mass spectrometry，HPLC-Q-TOF/MS） 美國Agilent公司；超純水儀 美國Milipore公司；冷凍干燥機 德國Christ公司；電子天平 梅特勒-托利多（上海）公司；離心機上海安亭離心機廠；氮吹儀 北京成萌偉業(yè)科技有限公司；組織勻漿器 上海標本磨具廠；數(shù)顯雙列四孔恒溫水浴鍋 金壇市岸頭良友實驗儀器廠；脫水機、半自動切片機 德國Leica公司；病理組織包埋冷凍臺、病理組織漂烘儀 常州市中威電子儀器有限公司；超低溫冰箱 青島海爾股份有限公司；顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗分組與處理

室溫（20±1）℃，12 h/12 h明暗交替，自由飲食。為了避免常規(guī)小鼠飼料當中豆源性原料對于實驗的干擾，全過程采用不含植物雌激素的特殊飼料進行喂養(yǎng)。將剛斷奶的21 日齡雌性小鼠隨機分為4 組（9 只/組）：槲皮素高、中、低劑量組（暴露劑量分別為45、25、5 mg/（kg·d））以及空白對照組（二甲基亞砜0.1 mL/d）。對小鼠進行灌胃，每日1 次。直至小鼠性成熟并出現(xiàn)3 次以上具有規(guī)律性的生殖周期，共連續(xù)灌胃50 d。待小鼠陰道口開張即性成熟后，以陰道涂片形式觀測其生殖周期變化。擇發(fā)情期于末次灌胃4 h后脫臼處死小鼠。收集血漿樣本以及乳腺組織，以HPLC-Q-TOF/MS分析槲皮素相關代謝物分布狀況，以免疫組織化學方法檢測小鼠乳腺上皮細胞相關指標（ERα、ERβ、PR、PCNA）表達水平。

1.3.2 組織樣本檢測前處理

取300 μL血漿或乳腺組織生理鹽水勻漿液，先后加入10 μL香葉木素溶液（10 μg/mL）、2 mL乙酸乙酯，漩渦混勻后3 000 r/min離心5 min，反復萃取4 次，合并上清液，氮氣吹干。將吹干樣品以50 μL甲醇+300 μL正己烷-氯仿（體積比1∶1）復溶，上葡聚糖凝膠柱。以6 mL正己烷-氯仿（體積比1∶1）洗脫即為脂溶相，再用5 mL甲醇洗脫即為水溶相，將兩相樣本以氮氣揮干，分別進行處理。

正己烷相：以200 μL甲醇復溶，加入1 g/100 mL脂肪酶溶液150 μL，37 ℃水浴酶解4 h，2 mL乙酸乙酯漩渦混勻，3 000 r/min離心5 min，萃取4 次，合并上清液，氮氣吹干。以200 μL甲醇復溶過濾膜，進樣檢測。

甲醇相：以200 μL甲醇復溶，調節(jié)pH值至4.9，漩渦混勻，加入5 μL β-葡萄糖醛酸酶和5 μL硫酸酯酶，漩渦混勻，在37 ℃水浴密閉酶解過夜。加入2 mL乙酸乙酯漩渦混勻，3 000 r/min離心5 min，萃取4 次，合并上清液，氮氣吹干。以200 μL甲醇復溶過濾膜，進樣檢測。

1.3.3 槲皮素以及其代謝產(chǎn)物異鼠李素的組織分布狀況檢測

參考文獻[6]的方法采用HPLC-Q-TOF/MS法檢測槲皮素及其代謝產(chǎn)物異鼠李素的組織分布狀況。色譜條件：C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為體積分數(shù)0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～1 min，10%～35% B；1～3 min，35% B；3～6 min，35%～80% B；6～8 min，80% B；8～9 min，80%～10% B；9～10 min，10% B；檢測波長360、260 nm；柱溫30 ℃；流速0.35 mL/min；進樣量5 μL。

質譜條件：使用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），在負離子模式下分別采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集范圍m/z 50～2 000；ESI參數(shù)：氣化室溫度350 ℃，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣（N2）體積流量10 L/min，裂解電壓180 V；定性離子：m/z 301、315。

1.3.4 乳腺上皮細胞內ER、PR以及PCNA表達水平檢測

取乳腺組織以中性福爾馬林固定12 h，常規(guī)梯度乙醇溶液脫水至組織呈透明，石蠟包埋并切片（厚度5 μm）。按照經(jīng)典的SP法免疫組化方法進行操作，嚴格按照相關試劑說明書進行染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，置于檸檬酸鈉緩沖液中以高壓鍋加熱加壓修復抗原；以體積分數(shù)3% H2O2浸泡封閉內源性過氧化物并以正常山羊血清工作液（體積分數(shù)7.5%）封閉，直接分別滴加一抗工作液ERα（1∶75）、ERβ（1∶75）、PR（1∶200）或PCNA（1∶250），4 ℃冷藏孵育過夜，磷酸鹽緩沖液清洗后滴加生物素偶聯(lián)山羊抗兔二抗工作液（1∶1 000）孵育25 min（37 ℃），辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，孵育25 min（37 ℃），DAB顯色，蘇木精復染，脫水-透明-中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，選取每個樣本3 張切片，每張切片取5 個400 倍鏡視野統(tǒng)計結果，其中DAB顯色呈褐色為陽性，而陰性染色細胞核因經(jīng)過蘇木精復染而呈現(xiàn)出藍色。結果評判標準：參照Remmele等[6]的免疫化學評分體系（immunohistochemical response score，IRS），采用染色強度（staining intensity，SI）和陽性細胞百分比（percentage of positively stained glands，PP）的乘積，即IRS＝SI×PP。SI分為4級：0級為未見陽性細胞即陰性，1級弱陽性，2級中等陽性，3級強陽性。PP分為5級：0級為陰性，1級≤25%，2級25%～50%，3級50%～75%；4級≥75%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 血漿及乳腺中槲皮素以及其代謝產(chǎn)物的含量檢測

本團隊前期已建立并報道了生物樣本中槲皮素相關代謝產(chǎn)物的檢測方法，在信噪比為3時檢出限可低至1 ng/mL且重復性佳[7]。以槲皮素標準品進樣質量濃度（X）對峰面積積分值（Y）進行線性回歸，在脂溶相以及水溶相中槲皮素標準品進樣在0.002～2 000 μg/mL范圍內均與峰面積積分值呈良好線性關系（表1）。

表1 各組織洗脫相中的槲皮素含量標準曲線回歸方程和相關系數(shù)Table1 Linear regression equations with coefficients of correlation for quercetin and isohamnetin dissolved in various phases

血漿以及乳腺組織局部的槲皮素相關代謝物含量與動物模型的槲皮素攝入量存在典型的劑量依賴性關系。不論是脂肪酸酯類產(chǎn)物還是結合型硫酸酯或葡萄糖醛酸酯類代謝產(chǎn)物在乳腺組織當中的含量均明顯大于血漿組織，體現(xiàn)出了顯著的組織富集效應（表2）。尤其是水溶性結合型代謝產(chǎn)物，乳腺組織局部濃度均值可達到血漿濃度的30 倍以上。提示乳腺組織對于槲皮素的暴露較為敏感。此外，在灌胃4 h后血漿中以槲皮素脂肪酸酯為主，而在乳腺組織內以水溶性結合型槲皮素代謝產(chǎn)物為主。

表2 各組織中槲皮素各類代謝產(chǎn)物分布Table2 Distribution of quercetin metabolites

2.2 長期槲皮素暴露對于乳腺上皮細胞PCNA表達水平的影響

PCNA是描述組織細胞增殖水平的經(jīng)典指標，以其為靶點可較為客觀地評價乳腺上皮細胞增殖的狀況。IRS評分結果顯示圍青春期的槲皮素長期攝入并沒有直接改變雌性小鼠成年后乳腺上皮的增殖狀況，與組織分析結果相一致（圖1）。

圖1 乳腺上皮細胞內PCNA免疫組織化學染色結果Fig.1 IHC staining of PCNA

2.3 長期槲皮素暴露對于乳腺上皮細胞ERα以及ERβ表達水平的影響

為考察槲皮素是否影響小鼠成年后乳腺上皮細胞對于生殖內分泌相關激素的敏感性，進一步分析了乳腺上皮細胞內ER的表達狀態(tài)。

圖2 ERα免疫組織化學染色結果Fig.2 IHC staining of ERα

圖3 ERβ免疫組織化學染色結果Fig.3 IHC staining of ERβ

局部組織ERα以及ERβ的表達水平和表達比例直接影響組織對于相關激素和激素類似物的反應性。經(jīng)免疫組織化學染色分析，低劑量組槲皮素長期暴露后明顯可誘導乳腺上皮細胞內ERα表達（圖2），而與ERα相反，乳腺上皮細胞ERβ的表達受到抑制（圖3）。由此乳腺組織上皮細胞內ERα與ERβ表達水平的比值被顯著上調。需要說明的是，這些效應在中、高劑量組中并沒有顯示出統(tǒng)計學差異。

2.4 長期槲皮素暴露對于乳腺上皮細胞PR表達水平的影響

圖4 PR免疫組織化學染色結果Fig.4 IHC staining of PR

PR是ER通路下游的重要分子指標，在乳腺組織的生長發(fā)育以及分化過程中起到非常重要的作用[8]。免疫組織化學染色分析顯示，PR的表達明顯受到了槲皮素長期暴露的阻遏，在中、低劑量組乳腺上皮細胞內PR表達量顯著低于空白對照組（圖4）。

3 討 論

近年來，乳腺癌以及乳腺相關疾病的發(fā)病率逐年上升，已成為危害女性健康的重要因素之一[9]。有研究報道表明，在幼年期內分泌干擾物的不當攝入會影響乳腺等激素敏感性組織的發(fā)育，并可能提高個體成年后罹患相關疾病的風險[3]。

槲皮素是正常膳食中廣泛存在的黃酮類活性物質[10]。由于許多研究報道表明其具有一定的抗氧化、抗腫瘤等生物學活性，因此富含槲皮素成分的膳食一直為人們所推崇[11-12]。然而需要指出的是槲皮素同時也可以在哺乳動物體內激活ER相關通路從而表現(xiàn)出類雌激素樣活性，屬于植物雌激素的范疇[13]。幼兒階段的個體，由于乳腺等雌激素敏感性組織處于發(fā)育階段且個體本底生殖內分泌激素水平較低，對于外源性雌激素樣內分泌干擾物的攝入尤其敏感[14]。為客觀評價膳食源性槲皮素對于人體健康的影響，在本研究中，以前期槲皮素膳食攝入水平評估原始數(shù)據(jù)為基礎，選擇相對較低的膳食暴露劑量，客觀評價在圍青春期這一生長發(fā)育敏感階段槲皮素的長期膳食攝入對于乳腺發(fā)育的影響。

研究結果提示：盡管在本研究考察劑量范圍（5～45 mg/（kg·d））內，圍青春期槲皮素的長期暴露并沒有明顯影響到成年雌性個體乳腺組織結構以及乳腺上皮細胞的增殖狀況，但是乳腺上皮細胞內ER的表達譜已發(fā)生了顯著性的改變，ERα表達上調而ERβ表達下調，ERα與ERβ表達水平比值明顯上升，且PR的表達也受到阻遏。這一現(xiàn)象與其他研究團隊關于染料木素等其他植物雌激素影響ER表達譜的報道相似[15-16]。

值得一提的是，槲皮素的生物學效應特點與染料木素等其他植物雌激素相類似，呈現(xiàn)出雙向“U”型效應，即在高劑量水平與低劑量水平下可表現(xiàn)出截然不同的甚至相反的生物學活性[17]。從本研究的數(shù)據(jù)中不難看出：槲皮素在中低劑量組中顯示出了更為顯著的生物學效應，而不是高劑量組，這并不符合常規(guī)的效量關系，這一現(xiàn)象與其他植物雌激素類物質的生物學活性研究結果相一致[17]。

部分細胞實驗研究報道槲皮素能誘導乳腺癌細胞凋亡，可作為預防或治療乳腺癌的有效化合物[18-19]，但其效果的產(chǎn)生往往需要較高的作用濃度（20～60 μmol/L）。需要說明的是，這一濃度水平通過正常的膳食攝入幾乎是不可能達到的。而Singh等[20]的動物實驗研究結果表明槲皮素可能會加劇雌性ACI大鼠中雌二醇（E2）誘導的乳腺腫瘤風險，因此槲皮素可能提高了乳腺組織對于E2促增殖效應的敏感性，與本研究中槲皮素暴露會上調小鼠成年后乳腺組織內ERα/β表達比結果相符。

眾所周知，ER、PR是相關生殖內分泌激素作用的主要靶分子，其在局部組織的表達水平可明顯影響相應組織對于相關激素以及激素樣活性物質的反應性，也極可能會影響到個體對于相關疾病致病因素的敏感性[21]。ER主要分為結構類似但生物功能相對獨立又彼此緊密聯(lián)系的ERα以及ERβ兩大亞型[22]。相關研究報道提示，ERβ可負向調控ERα介導的相關敏感性組織/細胞增殖的生物學過程，在組織分化以及乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中起到了非常重要的作用[23]。此外，PR的表達也可從一定程度上抑制乳腺發(fā)育過程中組織增殖并促進分化[24]。在本研究中，槲皮素在圍青春期的不當暴露提高了個體成年后乳腺上皮細胞內ERα/β表達比值，抑制了促進乳腺組織發(fā)育分化的PR表達，極可能提高乳腺組織對于促進其增殖、誘發(fā)其異常增生等各因素的敏感性，從而升高相應個人罹患相關疾病的風險。

需要說明的是：槲皮素不僅通過直接作用于激素敏感性組織本身，而且可能通過影響機體內整體的生殖內分泌平衡，來引發(fā)一系列的負面效應[25-26]。由此，槲皮素膳食攝入所可能引發(fā)的潛在危害，尤其是針對處于生長發(fā)育階段的嬰幼兒及青少年，應該給予重視。

此外，本團隊前期建立的化學分析方法可以在相關標準品缺乏的情況下，通過相應酶類的生物水解，精確分析槲皮素生物轉化產(chǎn)生的相應代謝物[7]。數(shù)據(jù)顯示，槲皮素在動物體內不僅可轉化為水溶性的硫酸酯以及葡萄糖醛酸酯類結合產(chǎn)物，還可以轉化為脂溶性的脂肪酸酯類產(chǎn)物。各類槲皮素代謝產(chǎn)物的組織內局部分布均呈現(xiàn)出劑量依賴性關系。需要特別關注的是，在乳腺組織中槲皮素相應代謝產(chǎn)物的含量均明顯高于血漿組織，體現(xiàn)出顯著的乳腺組織局部富集作用，因此，相對而言乳腺組織對于槲皮素的攝入更為敏感。由此也表明，單純以血漿當中相應代謝產(chǎn)物濃度為關注劑量，在細胞水平上討論槲皮素對于個體各組織器官的影響具有一定的局限性。

4 結 論

本研究以圍青春期雌性小鼠為模型從整體動物水平證實：乳腺對于槲皮素暴露具有較高的敏感性，槲皮素的長期暴露引發(fā)其相應代謝產(chǎn)物在乳腺組織當中進行局部富集；小鼠成年后乳腺上皮細胞內各生殖內分泌激素受體表達譜可被槲皮素暴露所干擾。在5 mg/（kg·d）劑量水平下，槲皮素可顯著上調乳腺上皮細胞內ERα與ERβ表達水平比值并且明顯抑制PR表達，改變乳腺組織對于生殖內分泌激素以及其外源類似物的敏感性，從而影響相應個體成年后罹患乳腺相關疾病的可能性。