黃晶晶，余 敏，馬 敏，鄢 嫣，張福生，殷俊峰，謝寧寧,*

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，安徽 合肥 230036）

鋅是人體必需的微量元素之一。它是機(jī)體內(nèi)近2 000 種轉(zhuǎn)錄因子的必需組成部分，與超過300 種代謝酶的活性有關(guān)，影響著機(jī)體的免疫系統(tǒng)和氧化還原平衡，可以作為慢性血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性病變、免疫紊亂和衰老等病理狀態(tài)下的抗氧化因子和抗炎癥因子[1]。肽金屬螯合物作為一種微量元素補(bǔ)充劑，可以通過肽的吸收途徑轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，吸收效率高、無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性，成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。金屬螯合肽（metal chelating peptide，MCP）通常能夠螯合Fe2+[2]、Fe3+[3]、Cu2+[4]、Zn2+[5]和Ca2+[6]等，但現(xiàn)有研究鮮見提及其結(jié)構(gòu)信息與螯合活性之間的關(guān)系。Torres-Fuentes等[7]認(rèn)為MCP和Cu2+的螯合能力與His含量有相關(guān)性（R2＝0.68）；de la Hoz等[8]發(fā)現(xiàn)His、Lys和Arg與酵母肽的Fe3+離子的螯合能力有關(guān)。目前只初步證明一些特征氨基酸在MCP結(jié)構(gòu)信息中的作用，同時(shí)，有關(guān)鋅螯合肽結(jié)構(gòu)對(duì)螯合活性的影響研究仍顯不足。

基于計(jì)算機(jī)輔助計(jì)算的定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）是將化合物的結(jié)構(gòu)信息、理化參數(shù)與生物活性進(jìn)行分析計(jì)算，建立合理的數(shù)學(xué)模型，已經(jīng)被成功運(yùn)用到苦味肽、抗菌肽、抗氧化肽[9]和降壓肽[10]等多種食源性活性肽中，為鋅螯合肽研究提供了切實(shí)可行的方法。QSAR基本思路包括：選擇、設(shè)計(jì)、合成一系列多肽類似物，并測(cè)定活性；對(duì)多肽類似物序列進(jìn)行定量表征；統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行建模；分析模型并預(yù)測(cè)優(yōu)異肽序列。近年來(lái)，QSAR的發(fā)展主要是對(duì)結(jié)構(gòu)表征中氨基酸描述符和數(shù)學(xué)建模中統(tǒng)計(jì)方法的研究[11]。氨基酸描述符分為2D描述符和3D描述符，2D描述符主要表征電荷性、疏水性、立體性和氫鍵屬性等參數(shù)。包括了TOF[12]、Z-scale[13]、VHSE[14]、DPPS[15]、T-scale[16]、HESH[17]、VMEE[18]、VSTV[19]、SZOTT[20]、FASGAI[21]、ST-scale[22]、VSTA[19]、SVG[23]、VSW[23]。Sneath等[24]首先進(jìn)行了肽的QSAR研究，使用了20 種編碼氨基酸的物化屬性作為描述符，通過定量序效模型（quantitative sequence-activity model，QSAM），分析了腦下垂體-抗利尿激素類似物。3D描述符主要表征側(cè)鏈表面積、側(cè)鏈電荷指數(shù)、拓?fù)鋮?shù)和幾何指數(shù)等參數(shù)，包括ISA-ECI[25]、MS-WHIM[26]。建模的分析方法有多元線性回歸、偏最小二乘法（partial least squares method，PLS）、支持向量機(jī)、主成分分析、逐逐步線性回歸、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法-PLS等[27]。

本研究前期采用多種商業(yè)蛋白酶水解菜籽蛋白，測(cè)得水解物的Zn2+螯合活性為33.35%～86.93%。以菜籽蛋白來(lái)源的活性肽ASH為基礎(chǔ)，利用多種金屬螯合活性較強(qiáng)的氨基酸（H、C、V、M、Y、D、Q、E、W）與其他氨基酸（A、G、I、L、F、S、T）進(jìn)行C端、N端替換，設(shè)計(jì)合成一系列多肽，形成待試數(shù)據(jù)庫(kù)，采用18 種氨基酸描述符，利用PLS統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行QSAR建模，揭示高螯合活性肽的結(jié)構(gòu)特征。利用兩端排序（two-terminal position numbering，TTPN）法將不同長(zhǎng)度的多肽進(jìn)行規(guī)格化，最大程度保留其結(jié)構(gòu)信息，使所有的樣品都能進(jìn)行表征建模。最后，對(duì)菜籽源的虛擬水解肽進(jìn)行活性預(yù)測(cè)，篩選出具有優(yōu)異螯合活性的小肽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

系列合成肽 百意欣生物公司；鋅試劑、鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液、無(wú)水乙醇（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷胱甘肽 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA1103N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；ZD-85氣浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；HR801酶標(biāo)分析儀 深圳市華科瑞科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鋅螯合肽數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

測(cè)定人工合成的51 條三肽、5 條四肽（序列基于前期研究所獲的菜籽源鋅螯合活性肽ASH，ASH來(lái)源于菜籽蛋白的12S球蛋白序列中的f204～206碎片）的鋅螯合率[28]，形成待試數(shù)據(jù)庫(kù)。所有的數(shù)據(jù)按照2∶1隨機(jī)分配成校正集、預(yù)測(cè)集。

鋅螯合活性參照汪嬋等[28]的方法測(cè)定，其活性是相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照的相對(duì)值。

1.3.2 氨基酸描述符數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

查閱收集到的18 種氨基酸描述符分為兩類，見表1。

表1 氨基酸描述符Table1 Amino acid descriptors

1.3.3 TTPN法

由于多肽數(shù)據(jù)庫(kù)中包含了三肽和四肽，而QSAR建模需要多肽的長(zhǎng)度相同，因此利用TTPN法將不同長(zhǎng)度的多肽進(jìn)行規(guī)格化，最大程度地保留其中的結(jié)構(gòu)信息，使所有的樣本都能進(jìn)行表征建模。

TTPN法的原理是找到最短序列的肽，并以此為標(biāo)準(zhǔn)，從兩端將多肽各復(fù)制此長(zhǎng)度的序列組成新的多肽。比如最短的為三肽，從兩端復(fù)制長(zhǎng)度為3的序列，組合最終得到六肽，這樣最大限度的保留了兩端的氨基酸信息。TTPN法原理如下式所示。

式中：y表示活性；i為N或C端的氨基酸位置；j為氨基酸描述符變量的個(gè)數(shù)；Ni,j和Ci,j分別表示N端和C端第i個(gè)氨基酸第j個(gè)變量。

1.3.4 肽結(jié)構(gòu)特征變量矩陣的建立

氨基酸描述符是將氨基酸結(jié)構(gòu)信息經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，壓縮變量維數(shù)，提取為幾個(gè)主成分。多肽結(jié)構(gòu)表征就是將多肽序列結(jié)構(gòu)用氨基酸描述符表示出一組特征參數(shù)，建立肽的結(jié)構(gòu)特征變量矩陣。對(duì)于三肽序列而言，變量總數(shù)為氨基酸描述符變量數(shù)目的3 倍。例如描述符Z含有3 個(gè)變量，則表征三肽的變量總數(shù)為3×3＝9。將鋅螯合肽數(shù)據(jù)庫(kù)中的每條肽序列從N端向C端表征，形成結(jié)構(gòu)特征變量矩陣X，同時(shí)活性數(shù)據(jù)形成矩陣Y。

1.3.5 PLS建模

采用PLS建模，模型的擬合能力通過累積決定系數(shù)R2和估計(jì)均方根誤差（root mean square error of estimation，RMSEE）評(píng)價(jià)。R2越高、RMSEE越低，擬合能力越好。同時(shí)，采用留一法對(duì)模型數(shù)據(jù)進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，評(píng)價(jià)其預(yù)測(cè)能力，最后計(jì)算交互驗(yàn)證決定系數(shù)Q2。一個(gè)具有較高擬合能力和預(yù)測(cè)能力的模型應(yīng)該具備的條件是：R2＞0.6，Q2＞0.5，對(duì)模型外部預(yù)測(cè)能力的評(píng)價(jià)是通過Qext2即外部驗(yàn)證系數(shù)以及預(yù)測(cè)方根誤差（root mean square of prediction，RMSEP）。分析平臺(tái)為Matlab 7.6.0，所有的變量經(jīng)過中心化處理因而具有均等的權(quán)重，樣本數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)隨機(jī)分配為校正集和預(yù)測(cè)集。對(duì)于校正集，使用交互驗(yàn)證作為內(nèi)部驗(yàn)證，主成分的個(gè)數(shù)是基于預(yù)測(cè)殘差平方和得出的。應(yīng)用Hotelling’s T2和殘差分析兩種方式考察異常點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋅螯合肽數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

鋅螯合肽數(shù)據(jù)庫(kù)見表2。在QSAR建模過程中，所有的數(shù)據(jù)按照2∶1隨機(jī)分配成校正集、預(yù)測(cè)集，因此校正集數(shù)量為37，預(yù)測(cè)集數(shù)量為19。校正集用于建立QSAR模型，同時(shí)進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，而預(yù)測(cè)集用于外部驗(yàn)證。

表2 鋅螯合肽數(shù)據(jù)庫(kù)Table2 Database of zinc-chelating peptides

2.2 鋅螯合肽氨基酸描述符以及QSAR模型的選擇

選擇合適的氨基酸描述符來(lái)描述不同種類、長(zhǎng)度的多肽是建模過程中關(guān)鍵的一步，匹配的描述符能夠最大程度地保留序列中的有用信息。另外，采用PLS建模能夠有效解決變量之間的共線問題，即使樣本數(shù)量小于變量數(shù)量也可以分析。研究首先通過TTPN法將不同長(zhǎng)度序列的多肽統(tǒng)一長(zhǎng)度，經(jīng)過18 種氨基酸描述符表征量化，并用PLS建模，再通過Hotelling’s T2和殘差分析去除異常點(diǎn)后，最終的模型結(jié)果如表3所示。

對(duì)于一個(gè)具有良好擬合能力和預(yù)測(cè)能力的QSAR模型，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)為：R2＞0.6、Q2＞0.5。從表3中可以看出18 種氨基酸描述符模型的相關(guān)系數(shù)，其中描述符Z、C、HESH、FASGAI、ST的模型的相關(guān)系數(shù)較好（R2為0.684 9～0.827 3；Q2為0.503 9～0.622 3），達(dá)到了R2＞0.6、Q2＞0.5的建模要求。

表3 使用18 種氨基酸描述符的QSAR模型Table3 QSAR models based on eighteen amino acid descriptors

同時(shí)，使用2D描述符普遍比使用3D描述符具有更好的相關(guān)系數(shù)和驗(yàn)證結(jié)果。在2D描述符的模型中，Z（R2＝0.733 4，Q2＝0.622 3）、FASGAI（R2＝0.827 3，Q2＝0.602 2）描述符模型最優(yōu)，TEN描述符模型雖然具有較高的校正集累積決定系數(shù)（R2＝0.827 2），但是交互驗(yàn)證系數(shù)（Q2＝0.413 0）不足以驗(yàn)證模型具有良好預(yù)測(cè)能力。描述符Z、FASGAI、VHSE、TEN的X矩陣中包括了立體性、疏水性、電性3 個(gè)屬性，而HESH、DPPS的X矩陣在這3 個(gè)變量的基礎(chǔ)上增加了氫鍵屬性，其QSAR模型的相關(guān)參數(shù)有所降低。雖然Z和FASGAI在X矩陣中的屬性相同，但它們是從物理化學(xué)屬性的不同范圍中提取，因此具有不同的變量數(shù)目（Z：3；FASGAI：6）。另外，從相關(guān)系數(shù)上比較，描述符FASGAI的模型的擬合能力更好。但是，在3D描述符的模型中，只有C、ST符合建模要求，雖然C描述符模型的R2較小，擬合能力低于ST，但是模型的內(nèi)部和外部預(yù)測(cè)能力都高于ST。

圖1 使用5 種氨基酸描述符校正集的計(jì)算值和觀察值的相關(guān)關(guān)系Fig.1 Correlation between calculated and observed values of a calibration set using 5 amino acids descriptors

Z、C、HESH、FASGAI、ST這5 種描述符模型校正集的觀察值與計(jì)算值的相關(guān)關(guān)系結(jié)果如圖1所示，其中，圖1d是使用FASGAI氨基酸描述符的QSAR模型。雖然有系統(tǒng)誤差存在，但是對(duì)于37 個(gè)樣本量的校正集，模型擬合較好，大部分落在對(duì)角線附近。

2.3 QSAR模型對(duì)鋅螯合多肽能力的預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)集不參與QSAR模型的建立，僅用于模型的外部驗(yàn)證，檢測(cè)模型的實(shí)際預(yù)測(cè)能力。表3顯示出使用FASGAI描述符的決定系數(shù)Q2ext為0.717 2、RMSEP為0.255 8，優(yōu)異于描述符Z、C、HESH、ST等相關(guān)系數(shù)，而其余的13 種描述符，其Q2ext均小于0.5，表明對(duì)應(yīng)的QSAR模型不具備良好的預(yù)測(cè)能力。

圖2 使用5 種氨基酸描述符的預(yù)測(cè)集的預(yù)測(cè)值和觀察值的相關(guān)關(guān)系Fig.2 Correlation between predicted and observed values of a prediction set using 5 amino acids descriptors

圖2 形象表明了不同描述符模型的預(yù)測(cè)能力，顯示了預(yù)測(cè)值與觀察值之間的關(guān)系。其中，圖2d是使用FASGAI氨基酸描述符的QSAR模型的外部驗(yàn)證效果。對(duì)于19 個(gè)樣本量的預(yù)測(cè)集，模型擬合較好，大部分落在對(duì)角線附近?；谝陨系慕Y(jié)果，使用FASGAI氨基酸描述符的QSAR模型最為優(yōu)良，因而FASGAI氨基酸描述符是最適合用于描述鋅螯合肽的結(jié)構(gòu)特征。

2.4 氨基酸描述符的屬性與活性之間的關(guān)系

在QSAR模型中，每個(gè)X變量對(duì)活性的貢獻(xiàn)大小可以通過測(cè)定變量投影重要性指標(biāo)（variable importance in project，VIP）值和對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)來(lái)判定[32]。

圖3 應(yīng)用FASGAI氨基酸描述符的QSAR模型的VIP值圖Fig.3 VIP values of the QSAR model with FASGAI amino acid descriptor

描述符FASGAI有6 個(gè)變量，因此通過TTPN處理后得到的六肽總共有36 個(gè)變量（6×6＝36），表示為X1～X36。圖3表明使用描述符FASGAI模型各變量的VIP值，可見變量X15、X21、X9、X3、X33、X27、X14、X23、X19、X36、X6對(duì)變量Y有較大的貢獻(xiàn)（VIP值＞1）。上述11 個(gè)VIP值大于1的變量也可表示為N3,3（FASGAI描述符中N端第3個(gè)位置上第3個(gè)變量）、C3,3（FASFAI描述符中C端第3個(gè)位置第3個(gè)變量）、N2,3、N1,3、C1,3、C2,3、N3,2、C3,5、C3,1、C1,1、N1,6，因?yàn)槊恳粋€(gè)變量都表示了序列中氨基酸殘基的位置以及對(duì)應(yīng)的理化屬性。

圖4 應(yīng)用FASGAI氨基酸描述符的QSAR模型的回歸系數(shù)圖Fig.4 Regression coefficients of the QSAR model using FASGAI amino acid descriptor

圖4 是上述11 個(gè)變量的回歸系數(shù)圖，表明變量矩陣X與變量矩陣Y之間的正負(fù)相關(guān)性：除了X19（C3,1）與鋅螯合肽活性呈正相關(guān)性，其余X15（N3,3）、X21（C3,3）、X9（N2,3）、X3（N1,3）、X33（C1,3）、X27（C2,3）、X14（N3,2）、X23（C3,5）、X36（C1,1）、X6（N1,6）都與鋅螯合肽活性呈負(fù)相關(guān)性。

氨基酸描述符FASGAI包括3 個(gè)物化屬性：疏水性、立體性、電性，立體性又具體分為α轉(zhuǎn)角、立體屬性、綜合特性、局部彈性4 個(gè)屬性，表4展示了上述11 個(gè)變量在序列中的位置以及對(duì)應(yīng)的物化屬性。

表4 數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)過PLS回歸分析后的VIP值、回歸系數(shù)以及位置信息Table4 Important properties of the peptides after PLS regression analysis

表5 基于VIP值總和確定肽序列中位置及屬性重要性Table5 Importance of structural properties and positions based on calculated VIP values

為了更清楚地研究序列中氨基酸殘基的位置對(duì)鋅螯合肽活性的影響，將序列中每個(gè)位置上不同屬性的VIP值求和（表5）。C3的VIP值最高，表明了序列中C3的位置對(duì)活性的影響最大，其中包括了變量X21（C3,3）、X19（C3,1）、X23（C3,5），屬性貢獻(xiàn)大小依次是立體屬性＞局部彈性＞疏水性，再根據(jù)表4中對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)，說(shuō)明在C3位置上，低空間屬性[X21（C3,3）]、局部彈性[X23（C3,5）]和高疏水性[X19（C3,1）]的氨基酸殘基可能提高鋅螯合肽活性。N3的VIP值排在C3之后，其中有變量X15（N3,3），X14（N3,2），屬性貢獻(xiàn)大小依次是空間屬性＞α轉(zhuǎn)角，并且在N3位置上，低空間屬性[X15（N3,3）]、低α轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基可能提高鋅螯合肽活性。VIP值排在第三位的是C1，包括了變量X33（C3,1）、X36（C1,1），屬性貢獻(xiàn)大小為空間屬性＞疏水性，表明C1位置上，低空間屬性、低疏水性的氨基酸殘基可能有利于鋅螯合肽活性。第四位是N1，變量包括X3（N1,3）、X6（N1,6），貢獻(xiàn)大小為空間屬性＞電性，在N1位置上，低空間屬性、低電性的氨基酸殘基可能利于對(duì)鋅螯合肽活性。VIP值排在最后的分別是N2、C2，只有一個(gè)屬性空間屬性貢獻(xiàn)較大，說(shuō)明在N2、C2位置上低空間屬性的氨基酸殘基對(duì)活性的預(yù)測(cè)有一定的作用。綜上可見，C3、N3在多肽序列中是主要影響鋅螯合活性的位置，其中較低立體屬性利于鋅螯合肽的活性。氨基酸微量元素鰲合物是以二價(jià)陽(yáng)離子與給電子體的氨基酸成配位鍵，同時(shí)又與給電子體的羰基中的氧構(gòu)成離子鍵形成五元環(huán)或六元環(huán)，而較低的立體屬性可能能夠減少螯合的空間位阻。從直觀比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中56 條多肽的活性來(lái)看，含有絲氨酸和半胱氨酸的多肽活性較高，絲氨酸、半胱氨酸的R基分別是—CH2—OH、—CH2—SH，具有很低的空間屬性、空間位阻。

3 結(jié) 論

本研究采用18 種氨基酸描述符，利用PLS統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)56 條合成肽進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。發(fā)現(xiàn)FASGAI、Z、HESH、C和ST這5 種氨基酸描述符對(duì)應(yīng)的QSAR模型相關(guān)系數(shù)達(dá)到建模要求，其中描述符FASGAI相關(guān)系數(shù)最優(yōu)，R2＝0.827 3、Q2＝0.602 2、RMSEE＝0.168 6、＝0.717 2、RMSEP＝0.255 8。隨后，采用TTPN法對(duì)描述符FASGAI所構(gòu)建的模型進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在菜籽源肽多肽序列中，氨基酸位置對(duì)多肽鋅螯合活性的影響力為C3＞N3＞C1＞N1＞N2＞C2。結(jié)果初步表明了在菜籽源的鋅螯合肽序列中C3、N3、C1這3 個(gè)位置的重要性，而且各位置氨基酸立體屬性較低的多肽擁有較高的鋅螯合活性，這與直觀比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中56 條多肽活性的結(jié)論相似。