張毅 ，王英 ，黃忍 ，李英林 ，邵靚 ，趙尊福

（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；3.四川省涼山州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 西昌 615000）

沙門菌是一種革蘭氏陰性桿菌，是最常見的人畜共患食源性致病菌之一。沙門菌引起的細(xì)菌性食物中毒高達(dá)70%～80%[1]，消費(fèi)者食用感染沙門菌的食物后，常表現(xiàn)出嘔吐、腹瀉、惡心、持續(xù)高熱等癥狀[2]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)沙門菌的研究多集中在禽類及豬、牛等動(dòng)物上，而鮮有關(guān)于山羊源沙門菌的報(bào)道。

沙門菌對(duì)各年齡段的山羊都能致病，對(duì)羔羊的危害最嚴(yán)重，臨床上主要以敗血癥、胃腸炎、下痢為主要特征。王晶晶等[3]對(duì)四川省部分地區(qū)表觀健康山羊的糞便進(jìn)行了沙門菌的分離鑒定，結(jié)果顯示山羊沙門菌的平均帶菌率高達(dá)54.59%。山羊攜帶沙門菌不僅僅導(dǎo)致自身發(fā)病，還會(huì)污染山羊的奶制品、肉制品，引發(fā)食源性中毒。本研究對(duì)四川地區(qū)226份山羊糞便樣本進(jìn)行了沙門菌的分離鑒定，并對(duì)分離出來(lái)的菌株進(jìn)行藥敏分析，旨在了解四川地區(qū)山羊沙門菌的攜帶情況及耐藥情況。

1 材料

1.1 菌株 本試驗(yàn)所用沙門菌（Salmonella）標(biāo)準(zhǔn)株CVCC528由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 樣本來(lái)源 從四川樂(lè)至、南江、金堂、青白江、攀枝花5個(gè)地區(qū)采集了158份山羊腹瀉糞便樣本和68份健康山羊糞便樣本，共計(jì)226份（表1）。

表1 山羊糞便樣本來(lái)源 份

1.3 主要試劑 Premix Taq、DL2000 DNA Marker，均購(gòu)自TaKaRa公司；BPW培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB），均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；電泳瓊脂糖，購(gòu)至OXOID公司；頭孢拉定、頭孢噻吩、氨芐青霉素、頭孢噻肟、阿莫西林、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、羅紅霉素、大觀霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、萬(wàn)古霉素、替考拉寧和丁胺卡那霉素18種藥敏片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 引物合成 引物為參考文獻(xiàn)[4]中的一對(duì)特異性檢測(cè)沙門菌invA基因的引物，上游引物：5′-GTGAAA TTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′，下游引物：5′-TCAT CGCACCGTCAAACCAACC-3′，引物長(zhǎng)度為289 bp，由生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離純化 取約1g糞便樣品用無(wú)菌生理鹽水稀釋至1mL，充分振蕩混勻后取500μL接種于BPW增菌液中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h；然后取1mL BPW增菌液接種于10mL TTB選擇性增菌液中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，無(wú)菌環(huán)境下劃線接種于SS瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)24h；觀察菌落形態(tài)，挑取疑似沙門菌菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

2.2 分離菌的PCR鑒定 先用酚氯仿法提取分離菌DNA，再用特異性PCR對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定。PCR反應(yīng)體系（20μL）：DNA模板2μL，上、下游引物各1μL，Premix Taq 10μL，ddH2O 6μL；PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并隨機(jī)抽取4份PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送生工生物工程有限公司測(cè)序，再將測(cè)序結(jié)果在GenBank上比對(duì)。

2.3 藥敏分析 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）2009年藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片擴(kuò)散法對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏分析。取0.5麥?zhǔn)蠁挝痪海ê繛?1×105～2×105CFU/mL）500μL，均勻涂布于 MH 藥敏瓊脂平板上，貼上藥敏片，37℃恒溫培養(yǎng)18h后測(cè)定抑菌圈直徑。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 結(jié)果顯示：158份腹瀉糞便樣本中，沙門菌的分離率為15.2%（34/158）；68份健康糞便樣本中，沙門菌的分離率為11.8%（8/68）；樣本總分離率為14.2%（32/226）（表2）。隨機(jī)抽取4份PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank Blast比對(duì)，證實(shí)是沙門菌invA基因特異性片段。

表2 226份糞便樣本中沙門菌的檢出率

3.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 所分離的32株沙門菌對(duì)頭孢拉定、頭孢噻吩、頭孢噻肟、慶大霉素、大觀霉素和丁胺卡那霉素的敏感率均為100%，對(duì)卡那霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明和替考拉寧有不同的耐藥性（耐藥率為21.9%～78.1%），對(duì)四環(huán)素、鏈霉素、羅紅霉素、氟苯尼考、萬(wàn)古霉素、氨芐西林和阿莫西林完全不敏感（表3）。

4 討論

目前檢測(cè)沙門菌的目標(biāo)基因有invA、ompC、ssrA、sefA、pefA等，特異性最強(qiáng)的有sefA、pefA和invA。sefA和pefA是檢測(cè)鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌的特異性基因，腹瀉糞便中沙門菌的血清型很多，為防止漏檢，需采用沙門菌屬共有的特異性基因?yàn)槟繕?biāo)基因，而invA基因序列為沙門菌屬所共有。本研究選擇沙門菌的侵襲蛋白基因invA為目標(biāo)基因，合成一對(duì)特異性引物，然后對(duì)分離的沙門菌進(jìn)行PCR鑒定，特異性好，鑒定結(jié)果可靠。

表3 32株沙門菌的耐藥性試驗(yàn)結(jié)果

沙門菌的耐藥機(jī)制主要包括基因突變引起的耐藥、細(xì)菌外排作用引起的耐藥、質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥等[5]。因基因突變引起沙門菌產(chǎn)生耐藥性主要體現(xiàn)在兩方面：抗生素靶基因突變與基因錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)突變。沙門菌通過(guò)改變抗生素靶基因表達(dá)產(chǎn)物的空間結(jié)構(gòu)而使抗菌藥物無(wú)法識(shí)別位點(diǎn)，從而產(chǎn)生耐藥性[6]。目前，喹諾酮類藥物是臨床上治療腸道致病菌感染的首選藥物，但Rushdy A A等[7]研究報(bào)道：27000株沙門菌分離株中，有13%對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥。本研究分離的沙門菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率高于Rushdy A A等的報(bào)道。耐藥性的產(chǎn)生還與臨床上抗生素的不規(guī)范使用，以及質(zhì)粒攜帶的耐藥基因擴(kuò)散耐藥性有關(guān)[8]。