杜國偉，晏 鑫，郭梓鑫，蔣佳志，黃 凱，李 勝，2，劉同族，3

(1.武漢大學中南醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430071；2.武漢大學中南醫(yī)院生物樣本庫，湖北武漢 430071；3.武漢市泌尿男生殖系腫瘤臨床研究中心，湖北武漢 430071)

膀胱癌是最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年有近74 000例新診斷的病例[1]。在中國，膀胱癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的癌癥，居所有癌癥中的第8位[2]。近3/4的高風險膀胱癌的患者將會復發(fā)、進展或診斷后10年內死亡[3]。盡管近年在診療方面取得了一定進展，但死亡率并沒有明顯改變[4]。因此，探索與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展以及預后密切相關的基因，具有十分重要的臨床意義。含有GTP酶異亮氨酸-谷氨酰胺序列激活蛋白3(IQ motif containing GTPase activating protein 3，IQGAP3)是一種可調節(jié)神經(jīng)突生長的基因，被認為是Rac1和Cdc42的效應子,是海馬神經(jīng)元軸突生長所必需的[5]。IQGAP3在HeLa細胞的胞質分裂中發(fā)揮重要作用，RNA干擾IQGAP3的表達能導致胞質分裂受阻，產生多核細胞[6]。近年來，IQGAP3在腫瘤中的報道呈不斷增多的趨勢。IQGAP3被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達增高，如在乳腺癌[7]、肺癌[8]、胰腺癌[9]和肝癌[10]。但是，國內外對于IQGAP3與膀胱癌的關系報道較少。因此，本研究通過生物信息學分析探討IQGAP3基因與膀胱癌的關系，分析膀胱癌的臨床特征和預后，為膀胱癌的研究和防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源從美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)的基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下載基因表達譜膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集GSE13507[11-12]。該數(shù)據(jù)集包含了165例原發(fā)性膀胱癌患者的基因表達譜及性別、年齡、TNM分期等臨床信息和10例正常膀胱組織的基因表達譜。在GSE13507中，IQGAP3基因對應的探針為ILMN_1813638。

1.2方法

1.2.1數(shù)據(jù)集篩選和臨床相關性研究 選擇GSE13507數(shù)據(jù)集中所有膀胱癌相關的樣本信息，排除臨床資料缺失的樣本。篩選完樣本后，對IQGAP3的表達量進行由高到低排序，中位數(shù)(10.60)之前的樣本作為高表達組(n=82)，之后的樣本作為低表達組(n=83)。

1.2.2基因集富集分析 基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)[13]采用GSEA 3.0版本進行分析。GSEA13507數(shù)據(jù)集中的腫瘤組織樣本，根據(jù)IQGAP3的表達水平高低被分為兩組，再通過GSEA分析IQGAP3的表達水平對各種生物通路基因集的影響。以Hallmark基因集為參照基因集，按照GSEA軟件默認參數(shù)進行GSEA分析，置換次數(shù)為1 000次。

1.3統(tǒng)計學處理使用SPSS 21.0和Graphpad Prism 6.01軟件進行統(tǒng)計分析。IQGAP3基因在正常膀胱組織和膀胱癌組織中的表達水平，采用兩獨立樣本均數(shù)比較的t檢驗；采用χ2檢驗分析IQGAP3基因表達高低與膀胱癌患者臨床特征的相關性；采用Log-rank檢驗進行各組間生存分析的比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；在GSEA中，以P<0.05及錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates，F(xiàn)DR)<0.25的基因集作為顯著富集基因集。

2 結 果

2.1IQGAP3在正常膀胱組織與膀胱癌細胞中的表達情況本研究比較正常膀胱組織細胞(n=10)與膀胱癌細胞(n=165)樣本中IQGAP3的表達情況，IQGAP3在膀胱癌細胞中表達水平為10.38±0.10，在正常膀胱組織中表達水平為7.74±0.12，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=6.435，P<0.0001)。以上結果表明膀胱癌組織IQGAP3的基因表達水平顯著高于正常膀胱組織(圖1)。

圖1 IQGAP3在膀胱癌組織與正常膀胱組織中的表達水平

2.2IQGAP3基因表達與膀胱癌患者臨床病理特征的相關性本研究選擇GSE13507數(shù)據(jù)集中165例膀胱癌患者的臨床病理特征與IQGAP3基因在膀胱癌患者表達水平的高低進行χ2檢驗分析。統(tǒng)計分析結果顯示(表1)，IQGAP3基因在膀胱癌中的表達水平與患者的年齡(P=0.001)、性別(P=0.042)、腫瘤的進展(P=0.002)、分級(P<0.001)、肌層浸潤(P<0.001)、T分期(P=0.001)、N分期(P=0.013)方面的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而與M分期(P=0.987)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3IQGAP3與膀胱癌患者的預后相關性利用生存分析評價IQGAP3基因與膀胱癌患者的預后相關性。本研究選取GSE13507數(shù)據(jù)集中腫瘤特異性生存結局、總生存結局及生存時間進行生存分析。統(tǒng)計分析結果顯示(圖2)，IQGAP3高表達患者和低表達患者的5年腫瘤特異性生存率分別為67.156%和93.318%(Log-rank=17.48，P<0.000 1，HR=0.185 9,95%CI：0.112 1～0.452 1，圖2A)，5年總生存率分別為49.100%和72.800%(Log-rank=13.04，P=0.000 3，HR=0.418 0，95%CI：0.256 4～0.666 2，圖2B)，差異有統(tǒng)計學意義。以上結果表明IQGAP3高表達組會影響膀胱癌患者的生存期，可作為膀胱癌患者預后的評價因子。

表1 IQGAP3基因表達水平與膀胱癌患者臨床病理特征的相關性 (例)

*：IQGAP3高表達N分期有1例數(shù)據(jù)缺失。

圖2 IQGAP3表達水平與膀胱癌患者的預后相關性A、B分別為與腫瘤特異性生存率、總生存率的關系。

2.4IQGAP3基因高表達的GSEA分析本研究選取GSEA13507數(shù)據(jù)集，運用GSEA分析方法初步分析IQGAP3基因表達水平對各種生物信號通路的影響，探討可能與之相關的機制。GSEA結果提示IQGAP3高表達的樣本富集了與調節(jié)精子發(fā)生、G2M檢查點、E2F信號通路、有絲分裂紡錘體、去折疊蛋白反應相關的基因集(表2)，表明IQGAP3可能通過調節(jié)這些生物學過程或通路等方式影響膀胱癌的發(fā)生及發(fā)展。

表2 IQGAP3高表達的膀胱樣本基因集富集分析

3 討 論

含有GTP酶異亮氨酸-谷氨酰胺序列激活蛋白(IQGAP)家族由3個成員組成：IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3。2007年IQGAP3基因開始被發(fā)現(xiàn)[5]，是這個家族的最新成員，它參與了上皮細胞的增殖，然而，其在腫瘤發(fā)生中的作用仍有待確定[14-15]。IQGAP3位于1q22染色體，這是癌癥基因擴增的熱點，并在肝臟和腸道等器官中受到限制性表達[5]。此前,相關研究表明IQGAP3基因可能參與多種癌癥的病理過程。例如，HU等[7]發(fā)現(xiàn)IQGAP3在乳腺癌中表達顯著增加，可作為乳腺癌進展期細胞增殖和轉移的關鍵調節(jié)因子；YANG等[8]研究發(fā)現(xiàn)IQGAP3在肺癌中高表達，它能促進肺癌細胞的生長以及遷移和侵襲；QIAN等[10]研究表明，IQGAP3在肝細胞肝癌中表達顯著高于肝硬化患者和健康對照者，可能成為肝細胞肝癌篩查和診斷的新型互補生物標志物。此外，KIM等[16]研究發(fā)現(xiàn)尿游離核酸IQGAP3明顯高于正常對照組，尿游離核酸IQGAP3可能是膀胱癌的補充診斷生物標志物。總之，以上文獻證實IQGAP3與腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關。然而，對于IQGAP3在膀胱癌中的表達以及臨床意義，國內外研究較少或不夠全面。

本研究通過回顧性分析發(fā)現(xiàn)，IQGAP3在膀胱癌組織中的表達比在正常組織中顯著增高，表明其在膀胱癌細胞中為高表達，可能作為促癌基因。進一步分析提示，IQGAP3的表達與膀胱癌患者的性別、年齡、腫瘤的進展、分級、肌層浸潤、T分期、N分期密切相關。高表達IQGAP3基因的膀胱癌患者腫瘤分期、疾病分級、病情進展、生存期方面明顯差于低表達IQGAP3的膀胱癌患者，說明IQGAP3基因的高表達與膀胱癌的惡性程度、疾病進展、預后相關，這與前面提到的國內外學者的研究結果相一致[7-8,10,16]。以上分析表明IQGAP3可能成為膀胱癌患者預后的評價分子之一。

探討IQGAP3基因可能調控的相關信號通路，相關研究證明IQGAP3特異性定位于有絲分裂后期的赤道皮層，通過調節(jié)相關蛋白在有絲分裂期間對收縮裝置的定位來影響細胞增殖分裂[17]。最新研究表明IQGAP3影響心肌細胞的細胞周期，通過IQGAP3與有絲分裂紡錘體的定位模式分析，區(qū)分心肌細胞的增殖與雙核化[18]。本研究通過GSEA分析顯示，IQGAP3可能通過多種與細胞周期相關的生物學過程(如精子發(fā)生、G2M檢查點、E2F信號通路、有絲分裂紡錘體、及未折疊蛋白反應)來調節(jié)膀胱癌細胞增殖，這與前面述及IQGAP3通過調節(jié)細胞周期影響細胞增殖的結果一致[17-18]，提示IQGAP3在膀胱癌細胞中也可能存在類似的機制，即IQGAP3可能通過調節(jié)膀胱細胞周期影響膀胱癌細胞的增殖。

綜上所述，IQGAP3在膀胱癌的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，可能成為潛在的判斷膀胱癌預后的標志物及腫瘤防治的新靶點。未來需開展更深入的機制研究加以驗證。