沈 敏， 楊曉東， 王 琳， 鄒繼華， 張 曼， 鄒炳德

（1. 美康生物參考實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315104；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100038）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是人體內(nèi)蛋氨酸和半胱氨酸代謝的重要中間產(chǎn)物[1]。正常人體內(nèi)Hcy濃度為5～15 μmol/L。由于遺傳或者其他因素使人體內(nèi)Hcy濃度持續(xù)高于正常值，即出現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）。近年來(lái)的研究結(jié)果表明，HHcy是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2-3]；同時(shí)，Hcy與冠狀動(dòng)脈疾病[4-5]、腦血管疾病[6-7]、糖尿病大血管病變[8]及靜脈血栓形成[9-10]等多種疾病有著非常重要的關(guān)系。因此，開(kāi)展Hcy普查對(duì)于某些疾病的預(yù)防、診斷及治療具有非常重要的意義。血漿Hcy主要包括3種形式[11]：70%～80%為蛋白結(jié)合型Hcy，20%～30%為Hcy二聚物或混合Hcy，只有1%為游離型Hcy。臨床上通常檢測(cè)的是總Hcy。

目前，總Hcy的檢測(cè)方法較多，包括循環(huán)酶法、熒光偏振法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）-電化學(xué)法、HPLC-熒光法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，G C-M S）及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（l i q u i d chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）等[12-17]。在這些方法當(dāng)中，生化法和免疫法雖然具有全自動(dòng)、快速的優(yōu)點(diǎn)，但其試劑昂貴，特異性較差，且檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性不佳。HPLC、GC-MS雖然準(zhǔn)確度較高，但樣本需要進(jìn)行衍生化等步驟處理，操作比較復(fù)雜且耗時(shí)。LC-MS/MS由于具有敏感性高、特異性好、準(zhǔn)確度高等突出優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已被用于總Hcy的臨床檢測(cè)。

臨床檢驗(yàn)參考方法廣泛應(yīng)用同位素稀釋質(zhì)譜（isotope-dilution mass spectrometry，IDMS）原理，在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會(huì)（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM） 2006年公布的國(guó)際臨檢參考方法列表中，有機(jī)小分子檢驗(yàn)項(xiàng)目57種參考方法中有52種基于ID-MS原理[18]?？侶cy檢測(cè)的參考方法也是基于ID-MS原理。目前，在JCTLM列表上公布的總Hcy參考方法有3種[19-20]，均由美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）開(kāi)發(fā)，對(duì)血清或血漿中總Hcy的檢測(cè)結(jié)果比較理想。但由于其選用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為DL-高胱氨酸，同位素內(nèi)標(biāo)為氘8-高胱氨酸，二者分子結(jié)構(gòu)均為2分子Hcy的巰基通過(guò)共價(jià)二硫鍵結(jié)合而成，需要對(duì)二者各自進(jìn)行還原，才能進(jìn)行準(zhǔn)確定量，而該還原過(guò)程操作較為繁瑣且耗時(shí)。因此，本研究在此基礎(chǔ)上，直接以Hcy單體作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以氘4-Hcy作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化色譜和質(zhì)譜檢測(cè)條件，以期能基于LC-MS/MS技術(shù)建立一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確且穩(wěn)定的候選參考測(cè)量程序，以實(shí)現(xiàn)血清總Hcy項(xiàng)目的量值傳遞，保證臨床常規(guī)檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX QTRAP 5500液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)SCIEX公司）、SUPELCOSIL LC-CN 色譜柱（250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm，美國(guó)SUPELCO公司）、XS 205DU型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）、Heidolph Multi Reax漩渦混合器（德國(guó)Heidolph公司）、Eppendorf 5427R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、Eppendorf移液器（德國(guó)Eppendorf AG公司）、容量瓶（日本ASone公司）、Milli-Q超純水系統(tǒng)（德國(guó)Millipore公司）。

DL-Hcy（即Hcy標(biāo)準(zhǔn)品）純度為95.6%，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；同位素內(nèi)標(biāo)DL-Hcy-2H4（簡(jiǎn)稱Hcy-d4）購(gòu)自美國(guó)IsoSciences公司，純度為98.88%，同位素豐度為99.72%；正確度驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 1950購(gòu)自NIST；DL-二硫蘇糖醇（薄層色譜級(jí)）和三氟乙酸（色譜級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甲醇（Optima LC/MS級(jí)）、甲酸（Optima LC/MS級(jí)）、乙腈（Optima LC/MS級(jí)）均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司。實(shí)驗(yàn)用水采用Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)品制備 用重量法分別精密稱取Hcy標(biāo)準(zhǔn)品、Hcy-d4內(nèi)標(biāo)，加水溶解并稀釋混勻，分別制備出500 μmol/L Hcy標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和100 μmol/L Hcy-d4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光2～8 ℃密封保存。精密稱取不同質(zhì)量的Hcy標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加入水稀釋并混勻，分別制備出0.5、2.0、5.0、10.0、15.0、30.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L共9個(gè)濃度梯度的Hcy標(biāo)準(zhǔn)工作液；同理，制備出10.0 μmol/L Hcy-d4標(biāo)準(zhǔn)工作液。以上溶液需計(jì)算溶液密度（g/mL），避光2～8 ℃密封保存。

1.2.2 樣本前處理 用重量法移取不同濃度的Hcy標(biāo)準(zhǔn)工作液或血清樣本100 μL 于1.5 mL離心管中，加入100 μL Hcy-d4標(biāo)準(zhǔn)工作液（重量法），然后再加入20 μL DL-二硫蘇糖醇溶液，渦旋混合2 min后室溫平衡15 min，加入200 μL乙腈[含0.05%三氟乙酸（V∶V）、0.1%甲酸（V∶V）]溶液，渦旋混合2 min后13 000×g離心5 min，取上清100 μL加入到進(jìn)樣瓶中，加入900 μL 10%甲醇（V∶V）水溶液稀釋至1 mL，混勻，用于LC-MS/MS分析。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱為SUPELCOSIL LC-CN色譜柱，流動(dòng)相A為0.1%甲酸甲醇溶液（V∶V），流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液（V∶V），流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為3 μL，梯度洗脫（0→7 min，10%A；7→9 min，10%A→100%A；9→12 min，100%A；12→13 min，100%A→10%A；13→15 min，10%A）。

1.2.4 質(zhì)譜分析條件 離子源為電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），離子化方式為正離子模式，離子化電壓為5 500 V，霧化溫度為550 ℃，碰撞氣強(qiáng)度為Medium，氣簾氣、霧化氣和輔助加熱氣分別為35 psi、55 psi、40 psi。以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描分析。具體參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3 方法性能評(píng)估

參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）C62-A文件[21]和C50-A文件[22]對(duì)建立的LC-MS/MS方法進(jìn)行基本分析性能驗(yàn)證。

表1 質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)設(shè)置

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性評(píng)價(jià) 用重量法各取9個(gè)濃度梯度的Hcy標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.5、2.0、5.0、10.0、15.0、30.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L）100 μL，按照樣本前處理?xiàng)l件進(jìn)行相同處理，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)2次，取均值。各濃度的檢測(cè)偏移＜15%， 且r＞0.99可判斷為呈線性。

1.3.2 檢測(cè)限與定量限 用生理鹽水對(duì)已知濃度的高濃度（10.91 nmol/g）血清樣本進(jìn)行稀釋，制備包括預(yù)期的定量限濃度在內(nèi)的3個(gè)濃度梯度的稀釋樣本，混勻，分別計(jì)算出每個(gè)濃度梯度樣本的理論濃度（C1），然后將定量限樣本各一式五份進(jìn)行處理后檢測(cè)，得到實(shí)際測(cè)定值（C2）。將同時(shí)滿足偏移 ＜20%、變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜20%、信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）≥1 0的濃度值定義為定量限，將S/N=3的計(jì)算濃度值定義為檢測(cè)限。

1.3.3 基質(zhì)效應(yīng) 采用基質(zhì)混合實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)檢測(cè)相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)，即通過(guò)檢測(cè)血清基質(zhì)樣本、溶液基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、血清和溶液1∶1（質(zhì)量比）混合物、血清和溶液80∶20（質(zhì)量比）混合物、血清和溶液20∶80（質(zhì)量比）混合物這5種基質(zhì)樣本（各5份）中標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值來(lái)計(jì)算相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)。第1組：100 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液+100 μL內(nèi)標(biāo)，共5份樣本，經(jīng)前處理進(jìn)樣得到標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值A(chǔ)；第2組：100 μL血清+100 μL內(nèi)標(biāo)，共5份樣本，經(jīng)前處理進(jìn)樣得到標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值B；第3組：50 μL血清+50 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液+100 μL內(nèi)標(biāo)，共5份樣本，經(jīng)前處理進(jìn)樣得到標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值C；第4組：80 μL血清+20 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液+100 μL內(nèi)標(biāo)，共5份樣本，經(jīng)前處理進(jìn)樣得到標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值D；第5組：20 μL血清+80 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液+100 μL內(nèi)標(biāo)，共5份樣本，經(jīng)前處理進(jìn)樣得到標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值E。以上操作均用重量法。1∶1混合物相對(duì)基質(zhì)效應(yīng) =[C-（A+B）/2]/[（A+B）/2]×100%；80∶20混合物的相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)=[D-（0.2A+0.8B）]/（0.2A+0.8B）×100%；20∶80混合物的相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)=[E-（0.8A+0.2B）]/（0.8A+0.2B）×100%。如果3種混合物中標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值與對(duì)應(yīng)比例血清基質(zhì)樣本和溶液基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值的均值差異 ＜20%，則視為無(wú)相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)。

1.3.4 攜帶污染 在評(píng)估攜帶污染時(shí)，先重復(fù)進(jìn)樣低值樣本（定量限濃度樣本），然后交替進(jìn)樣高值（79.56 nmol/g）樣本（H）和低值0.31 nmol/g樣本（L），進(jìn)樣順序如下：L1、L2、L3、H1、H2、L4、H3、H4、L5、L6、L7、L8、H5、H6、L9、H7、H8、L10、H9、H10、L11。比較第1次進(jìn)樣（L1）后跟隨的低值樣本檢測(cè)結(jié)果的平均值A(chǔ)（即L2、L3、L6、L7、L8的平均值）與隨后進(jìn)樣的高值樣本后跟隨的低值樣本檢測(cè)結(jié)果的平均值B（即L4、L5、L9、L10、L11的平均值）的差異，若低于預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)[以20%為限，攜帶污染率=（B-A）/A×100%]，則認(rèn)為在測(cè)定該高值及以下濃度時(shí)不存在明顯的攜帶污染。

1.3.5 精密度評(píng)價(jià) 采用低（11.29 μmol/L）、中（48.83 μmol/L）、高（81.86 μmol/L）3個(gè)濃度的混合血清作為待測(cè)樣本，將混合血清分裝后-70 ℃保存，對(duì)每個(gè)濃度樣本每批次各5份進(jìn)行樣本前處理，連續(xù)測(cè)定3個(gè)批次，分別計(jì)算批內(nèi)CV和批間CV。

1.3.6 正確度驗(yàn)證 分別采用加標(biāo)回收和測(cè)定有證參考物質(zhì)2種方式對(duì)方法的正確度進(jìn)行評(píng)價(jià)。（1）加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)：取3個(gè)已知濃度（10.91、47.60、79.56 nmol/g）的混合血清，采用重量法各取0.5 mL，加入50.58 μmol/L Hcy標(biāo)準(zhǔn)工作液0.5 mL（重量法），混勻，制備出3個(gè)濃度的加標(biāo)樣本，分別計(jì)算出理論濃度，然后將各個(gè)濃度的加標(biāo)樣本（各5份）進(jìn)行處理后進(jìn)樣檢測(cè)，得到實(shí)際測(cè)定值，計(jì)算加標(biāo)回收率?；厥章试?5%～105%之間為可接受。（2）有證參考物質(zhì)測(cè)定：采用本研究建立的LC-MS/MS方法測(cè)定NIST SRM 1950，對(duì)每個(gè)批次5份樣本進(jìn)行前處理，連續(xù)測(cè)定2個(gè)批次，考察方法的正確度。

1.3.7 穩(wěn)定性 目標(biāo)分析物的穩(wěn)定性對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響非常大，必須對(duì)其加以評(píng)估。以精密度驗(yàn)證樣本中的低濃度血清樣本為穩(wěn)定性研究樣本，通過(guò)以下2個(gè)方面評(píng)估目標(biāo)分析物的穩(wěn)定性：（1）在生物基質(zhì)中的穩(wěn)定性，包括室溫放置4～24 h的穩(wěn)定性、2～8 ℃保存1～4 d的穩(wěn)定性及反復(fù)凍融的穩(wěn)定性；（2）處理后樣本的穩(wěn)定性，包括處理后室溫放置4～24 h的穩(wěn)定性、處理后自動(dòng)進(jìn)樣器放置4～24 h的穩(wěn)定性。

1.4 不確定度評(píng)估

依據(jù)《測(cè)量不確定度表示指南》（Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，簡(jiǎn)稱GUM），測(cè)量結(jié)果的濃度計(jì)算公式為C=（A/AIS-b）/k×fc×fm，式中C為總Hcy的測(cè)量濃度（μmol/L）、A/AIS為樣本與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值、b為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距、k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率、fc為標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)溶液濃度修正因子、fm為樣本處理修正因子。從標(biāo)準(zhǔn)工作液配制、樣本處理、儀器檢測(cè)及重復(fù)測(cè)量4個(gè)方面分析不確定度來(lái)源，并量化各個(gè)分量。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性評(píng)價(jià)

LC-MS/MS檢測(cè)血清總Hcy的色譜圖見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，線性范圍為0.5～200.0 μmol/L。

圖1 Hcy和Hcy-d4的色譜圖

圖2 LC-MS/MS檢測(cè)血清總Hcy的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 檢測(cè)限與定量限

LC-MS/MS檢測(cè)血清總Hcy的定量限為0.31 nmol/g，檢測(cè)限為0.06 nmol/g。見(jiàn)表2。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

采用基質(zhì)混合實(shí)驗(yàn)考察相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)。5份溶液基質(zhì)樣本的峰面積比值分別為0.907、0.920、0.920、0.920、0.920，平均值為0.917。5份血清基質(zhì)樣本的峰面積比值分別為1.030、1.033、1.047、1.040、1.033，平均值為1.037。5份1∶1混合物樣本的峰面積比值分別為0.970、0.953、0.957、0.957、0.953，平均值為0.958。5份80∶20混合物樣本的峰面積比值分別為0.993、0.998、0.987、1.003、0.995，平均值為0.995。5份20∶80混合物樣本的峰面積比值分別為0.924、0.925、0.919、0.923、0.922，平均值為0.923。計(jì)算得到相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)分別為1.94%、1.91%、1.78%。

2.4 攜帶污染

通過(guò)多次高值樣本和低值樣本交替重復(fù)進(jìn)樣，計(jì)算得攜帶污染率為2.86%，因此可認(rèn)為該方法不存在明顯的攜帶污染。

2.5 精密度評(píng)價(jià)

采用LC-MS/MS定量檢測(cè)混合血清總Hcy濃度，批內(nèi)、批間CV分別為＜2%和＜1%，見(jiàn)表3。

2.6 正確度驗(yàn)證

2.6.1 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 加標(biāo)后3種濃度的血清樣本平均回收率分別為99.8%、100.2%、100.8%，準(zhǔn)確度符合要求，見(jiàn)表4。

表2 Hcy的定量限評(píng)估結(jié)果

表3 LC-MS/MS精密度評(píng)價(jià)結(jié)果

表4 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

2.6.2 參考物質(zhì)測(cè)定 采用NIST SRM 1950標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[證書(shū)濃度為（8.50±0.20）μmol/L]進(jìn)行正確度驗(yàn)證，連續(xù)測(cè)定2個(gè)批次，其測(cè)定均值、CV和偏移分別為8.55 μmol/L、1.65%、0.59%和8.49 μmol/L、1.35%、-0.12%，具有很高的正確度。

2.7 穩(wěn)定性

2.7.1 在生物基質(zhì)中的穩(wěn)定性 低濃度血清樣本在室溫[（23±2 ）℃]放置24 h、2～8 ℃放置4 d、反復(fù)凍融5次的情況下穩(wěn)定。

表5 生物基質(zhì)樣本中Hcy的穩(wěn)定性

2.7.2 處理后樣本的穩(wěn)定性 樣本處理后室溫[（23±2 ）℃]放置24 h和自動(dòng)進(jìn)樣器（溫度為10 ℃）放置24 h均非常穩(wěn)定。

表6 處理后樣本中Hcy的穩(wěn)定性

2.8 不確定度評(píng)估

從標(biāo)準(zhǔn)工作液配制、樣本處理、儀器檢測(cè)及重復(fù)測(cè)量4個(gè)方面評(píng)估精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)定的3種濃度樣本測(cè)量結(jié)果的不確定度。結(jié)果顯示候選參考測(cè)量程序測(cè)定血清總Hcy濃度產(chǎn)生的不確定度較為合理。見(jiàn)表7。

表7 3種不同濃度樣本測(cè)定結(jié)果不確定度的評(píng)估結(jié)果

3 討論

HHcy是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。體內(nèi)Hcy濃度升高與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、高血壓、糖尿病、腎病、孕婦流產(chǎn)、新生兒缺陷等多種疾病有關(guān)。目前，臨床上已經(jīng)將Hcy列為多種疾病診斷的重要指標(biāo)?？焖佟?zhǔn)確地檢測(cè)體內(nèi)Hcy濃度可以為某些疾病的預(yù)防、診斷及治療提供依據(jù)。因此，開(kāi)發(fā)出快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)方法顯得尤為重要。LC-MS/MS結(jié)合了液相色譜分離與質(zhì)譜質(zhì)量分離的優(yōu)點(diǎn)，敏感性高、特異性好?；谕凰叵♂尩腖C-MS/MS保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，近年來(lái)已被用于總Hcy的臨床檢測(cè)。

本研究基于JCTLM公布的總Hcy參考測(cè)量程序，建立一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確且穩(wěn)定的候選LC-MS/MS參考測(cè)量程序。在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和同位素內(nèi)標(biāo)的選擇上，NIST選用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為DL-高胱氨酸，同位素內(nèi)標(biāo)為氘8-高胱氨酸，而本研究選擇Hcy單體作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，氘4-Hcy作為同位素內(nèi)標(biāo)，無(wú)需還原步驟，直接以此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。LC-MS/MS檢測(cè)總Hcy的過(guò)程涉及3個(gè)關(guān)鍵步驟：樣本前處理、色譜條件和質(zhì)譜條件的選擇。在樣本的前處理上，本研究選擇以二硫蘇糖醇為還原劑，在NIST參考方法的基礎(chǔ)上對(duì)其濃度和加入量進(jìn)行了微調(diào)，以保證所有結(jié)合型Hcy全部還原為游離型；同時(shí)，延長(zhǎng)了蛋白沉淀后的離心時(shí)間，在保證檢測(cè)敏感性的前提下對(duì)上清液進(jìn)行了稀釋，以減小基質(zhì)效應(yīng)的影響。在色譜條件的選擇上，本研究選用的色譜柱、流動(dòng)相、柱溫、流速與NIST參考方法保持一致，但對(duì)其梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化，降低了流動(dòng)相中水相的初始比例，同時(shí)減緩了梯度，以減小各種內(nèi)源性干擾物質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物的影響。質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要是調(diào)整各個(gè)參數(shù)，使Hcy分子的母離子得到最佳的響應(yīng)值。本研究使用ESI對(duì)Hcy進(jìn)行Q1全掃描，獲得m/z 136.1的[M+H]+峰，內(nèi)標(biāo)的[M+H]+峰為m/z 140.1，以各自的分子離子峰為母離子，對(duì)離子源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使其各自的響應(yīng)值達(dá)到最佳，然后對(duì)其各自的子離子進(jìn)行全掃描，確定特征碎片離子，組成MRM離子通道。本研究Hcy定量檢測(cè)的MRM離子通道為m/z 136.1/90.0，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)定量的通道為m/z 140.1/94.0。

參照CLSI C62-A文件和C50-A文件對(duì)建立的候選參考方法進(jìn)行分析性能驗(yàn)證。在建立方法時(shí)，所有的溶液配制和樣本移取均采用重量法；在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)品定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)的摩爾比為橫坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行直線擬合。結(jié)果顯示LC-MS/MS檢測(cè)總Hcy的線性范圍為0.5～200.0 μmol/L，定量限和檢測(cè)限分別為0.31和0.06 nmol/g。該方法的敏感性和線性范圍完全能夠滿足常規(guī)檢測(cè)的溯源要求。相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)為2.04%，證明采用同位素內(nèi)標(biāo)能夠校正基質(zhì)效應(yīng)的影響。精密度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，本方法的批內(nèi)、批間CV分別為＜2%和 ＜1%，3種濃度的加標(biāo)樣本平均加標(biāo)回收率分別為99.8%、100.2%、100.8%。Hcy的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 1955已經(jīng)從NIST標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)列表中刪除，本方法測(cè)定NIST SRM 1950標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的偏移＜1%，精密度和正確度符合參考測(cè)量程序的要求。LCMS/MS參考測(cè)量程序的定量分析方法一般采用包括法。標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)組分的量與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的量的比值控制在0.9和1.1，樣本中被測(cè)組分的量與內(nèi)標(biāo)的比值盡量控制在1.0左右。該方法能非常準(zhǔn)確地測(cè)定待測(cè)組分的濃度，但操作較繁瑣，需要對(duì)待測(cè)樣本先測(cè)定一個(gè)初步濃度值，再采用包括法進(jìn)行準(zhǔn)確定量。最近，JCTLM公布了一種采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)25-羥基維生素D進(jìn)行準(zhǔn)確定量的參考測(cè)量程序[23]，其采用高、低濃度2條標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)高濃度樣本采用高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，對(duì)低濃度樣本采用低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，避免了二次測(cè)量，從而簡(jiǎn)化了操作。本研究采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法建立了血清Hcy的參考測(cè)量程序，其正確度和精密度符合參考測(cè)量程序的要求，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線法也可以作為準(zhǔn)確定量的方法。

綜上所述，本研究建立的基于LC-MS/MS的血清總Hcy候選參考測(cè)量程序具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好、運(yùn)行穩(wěn)定等特點(diǎn)，能夠用于總Hcy項(xiàng)目的量值溯源和標(biāo)準(zhǔn)化及常規(guī)檢測(cè)系統(tǒng)的正確度評(píng)價(jià)，在臨床檢驗(yàn)中具有實(shí)用價(jià)值。