顧娜，張桂賢 ，史鵬程，譚珵，劉偉偉，趙秀梅 ，劉洪斌△，田瑛澤，胡志潔

大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）嚴(yán)重影響人類生命健康，尤其是與呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)疾病發(fā)病率和死亡率直接相關(guān)［1-2］。PM2.5因直徑微小，重力作用小，可沉積于細(xì)支氣管和肺泡內(nèi)并被肺泡內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬。肺泡巨噬細(xì)胞（AM）是肺泡腔內(nèi)常駐的免疫細(xì)胞，吞噬、免疫和分泌作用都十分活躍，是肺組織免疫系統(tǒng)的第一道天然屏障。空氣中的塵粒（包括PM2.5）、細(xì)菌等異物進(jìn)入肺泡和肺間質(zhì)后多被巨噬細(xì)胞吞噬而形成塵細(xì)胞，吞噬異物的塵細(xì)胞，有的從肺泡腔經(jīng)呼吸道黏液流動(dòng)和纖毛運(yùn)動(dòng)被咳出，有的進(jìn)入肺淋巴管隨淋巴液進(jìn)入肺淋巴結(jié)內(nèi)。當(dāng)肺泡巨噬細(xì)胞被過度激活后可釋放多種炎癥因子及炎癥介質(zhì)，造成炎癥的級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)，最終可導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生［3］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3，NLRP3）炎性小體是目前研究較為成熟的炎性復(fù)合體家族成員之一，是機(jī)體固有免疫的一部分，激活后參與免疫調(diào)節(jié)及抵抗外來病原體（例如細(xì)菌、病毒）的過程。NLRP3炎性小體過度激活參與許多肺部疾?。勐宰枞苑渭膊。–OPD）、哮喘等］的發(fā)病過程［4］。關(guān)于PM2.5的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)大多集中于支氣管和肺泡上皮細(xì)胞，其對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的影響也僅局限于體外實(shí)驗(yàn)。本研究通過體內(nèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)觀察肺巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體活化通路與PM2.5致肺損傷的關(guān)系，為今后的臨床治療和新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 磷酸鹽緩沖液（PBS，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基（GIBCO）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；乙酸、無水乙醇（天津市化學(xué)試劑供銷公司）；二甲苯、中性樹膠（國藥集團(tuán)）；蘇木素（Sigma）；NLRP3兔多克隆抗體（Abcam）；F4/80抗體（Santa Cruz）；濃縮型正常山羊血清、熒光（FITC）標(biāo)記羊抗小鼠IgG、熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；DAPI（碧云天生物技術(shù)）；抗熒光淬滅封片劑（SouthernBiotech）；白細(xì)胞介素（IL）-18、IL-1β及半胱天冬酶-1（Caspase-1）的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.2 儀器與設(shè)備 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；離心機(jī)（LD5-2B，北京京立離心機(jī)有限公司）；多功能酶標(biāo)儀infinite M200（瑞士TECAN公司）；CO2培養(yǎng)箱（REVCO）；顯微鏡（奧林巴斯BX53型生物顯微鏡）；24孔板（美國COSTAR）。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5的采集和處理 采樣地點(diǎn)為南開大學(xué)理化樓樓頂，采樣時(shí)間為2014年11月19日—2015年2月6日。PM2.5采用中流量采樣器（TH-150C，天虹，中國）載帶石英濾膜進(jìn)行采樣，設(shè)計(jì)流量100 L/min，每張濾膜連續(xù)采樣22 h（即當(dāng)日09：00—次日07：00），雨雪天停止采樣。采樣后將載有顆粒物的濾膜剪裁成3 cm×1 cm大小，浸入去離子蒸餾水中超聲3次，每次振蕩40 min洗脫顆粒物，震蕩液經(jīng)六層紗布過濾，濾液即為PM2.5混懸液，混懸液經(jīng)冷凍真空干燥，低溫冰箱保存?zhèn)溆?。臨用前稱取處理好的PM2.5，用生理鹽水配成所需濃度后超聲振蕩15 min，混勻并高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?，液體1周內(nèi)用完，臨用前再次超聲振蕩使顆粒物充分混勻。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模 選用SPF級(jí)健康雄性大鼠32只，體質(zhì)量250 g左右，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK-（軍）2014-0001。將動(dòng)物按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組、低劑量組（5 mg/kg）、中劑量組（10 mg/kg）、高劑量組（15 mg/kg），每組8只動(dòng)物。分組后將動(dòng)物按1 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，取仰臥位固定，3～5 min待呼吸平穩(wěn)后，消毒頸部皮膚，去毛、再消毒后，在頸部中線下段切開皮膚，用血管鉗鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露氣管（長約1 cm），在兩氣管軟骨環(huán)之間刺入針頭，經(jīng)氣管緩慢注入PM2.5懸液（體積為2 mL/kg體質(zhì)量），注入后立即將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使顆粒物盡量均勻分布，待呼吸平穩(wěn)后為預(yù)防感染在切口處滴注青霉素然后縫合切口；對(duì)照組氣管滴注相應(yīng)體積的生理鹽水。灌注術(shù)后動(dòng)物自由飲食、飲水，造模后3 d處死動(dòng)物。

1.2.3 大鼠肺灌洗及肺巨噬細(xì)胞吞噬功能測定 造模結(jié)束后斷頭放血處死大鼠，暴露氣管并剪一斜口，插入帶有聚乙烯管的肺灌洗針頭，結(jié)扎固定。緩慢注入PBS并緩慢抽出灌洗液，邊操作邊輕輕按摩胸部以增加灌洗液的洗出量。每只大鼠灌洗4次，記錄每只大鼠灌洗液總量。將提取的灌洗液經(jīng)4℃、1 000 r/min離心10 min，下層細(xì)胞沉淀用含10%小牛血清的RPMI 1640液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL，取1 mL加入24孔板中，置37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，用PBS沖洗掉未黏附的細(xì)胞。每孔加入1 mL 0.1%的中性紅溶液孵育15 min，棄去孔中溶液并沖洗未被吞噬的中性紅，每孔加入1 mL現(xiàn)配的細(xì)胞裂解液（1∶1混合的乙酸和無水乙醇）靜置過夜，在550 nm波長下用酶標(biāo)儀比色，記錄各孔光密度（OD）值，計(jì)算抑制率。抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.4 肺組織HE染色及病理學(xué)評(píng)分 末次染毒結(jié)束后斷頭放血處死大鼠，解剖取相應(yīng)肺臟，10%的中性福爾馬林固定、梯度脫水、正丁醇透明、石蠟包埋，間斷連續(xù)切片（5μm厚），HE染色、脫水、透明、封片，做常規(guī)的病理學(xué)檢查并進(jìn)行肺組織損傷評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）肺間質(zhì)水腫。（2）肺泡水腫。（3）炎細(xì)胞浸潤。（4）肺泡出血。（5）肺泡結(jié)構(gòu)完整性破壞。每項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)按無、輕、中、重分別標(biāo)記為0、1、2、3分，然后累計(jì)總分為肺組織的病理評(píng)分［5］。

1.2.5 免疫組化檢測NLRP3表達(dá) 將肺組織標(biāo)本切片脫蠟和水化，微波抗原修復(fù)，3%的H2O2孵育30 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，TBST洗滌5次，每次3 min。血清封閉，一抗NLRP3（1∶100）孵育過夜，TBST洗滌5次，每次3 min。滴加對(duì)應(yīng)的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌5次，每次3 min。應(yīng)用DAB溶液顯色，PBS沖洗，蘇木素復(fù)染、脫水、二甲苯透明，中性膠封片晾干，顯微鏡下觀察肺組織內(nèi)NLRP3蛋白的表達(dá)量。細(xì)胞胞漿有棕黃色顆粒為陽性，不著色者為陰性。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)讀取10個(gè)不重疊高倍（×400）視野，各視野得分的平均值作為最終得分；使用Image Pro Plus（IPP）Version 6.0圖像分析軟件，對(duì)選取視野內(nèi)免疫組化陽性信號(hào)進(jìn)行光強(qiáng)度及面積分析，計(jì)算對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組NLRP3表達(dá)的積分光密度（IOD）值［6］。

1.2.6 免疫熒光雙染色檢測NLRP3表達(dá) 將肺組織標(biāo)本切片脫蠟，微波抗原修復(fù)，血清封閉以減少非特異性染色，一抗F4/80（1∶100）孵育過夜，TBST洗滌5次，每次3 min。加入熒光（FITC）標(biāo)記羊抗小鼠IgG（1∶100），室溫孵育1 h，TBST洗滌5次，每次3 min。血清封閉，一抗NLRP3（1∶100）孵育過夜，TBST洗滌5次，每次3 min。加入熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶100），室溫孵育1 h，TBST洗滌5次，每次3 min。PBS充分漂洗后避光進(jìn)行DAPI染色，TBST洗滌5次，每次3 min。綠色熒光標(biāo)記的是FITC陽性肺巨噬細(xì)胞，而紅色熒光標(biāo)記的是Cy3陽性的NLRP3蛋白。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像并計(jì)算對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組IOD值［7］。

1.2.7 肺組織IL-18、IL-1β及Caspase-1的表達(dá)檢測 取肺組織在4℃預(yù)冷的PBS中漂洗，無菌紗布拭干，稱質(zhì)量，無菌注射器抽取9倍肺質(zhì)量的預(yù)冷PBS，眼科剪剪碎并用玻璃勻漿管勻漿，上下轉(zhuǎn)動(dòng)8次左右，移入離心管內(nèi)，4℃、3 000 r/min離心15 min，取上清，分裝并于-80℃保存?zhèn)溆谩０碋LISA試劑盒說明書測定肺組織內(nèi)IL-18、IL-1β及Caspase-1的表達(dá)情況，同時(shí)在酶標(biāo)包被板設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔以及待測樣品孔。反應(yīng)終止后，450 nm波長依序測量各孔的OD值，計(jì)算樣品濃度［8］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺巨噬細(xì)胞吞噬功能測定 不同劑量的PM2.5對(duì)大鼠肺巨噬細(xì)胞的吞噬功能均有不同程度的抑制，且隨PM2.5劑量增加，抑制率逐漸增高（低、中、高劑量組抑制率分別為17.07%、31.70%、38.90%，P＜0.05），見表1。

2.2 肺組織HE染色及病理學(xué)評(píng)分 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織HE染色主要表現(xiàn)為不同程度的肺間質(zhì)肺炎，肺泡出血、水腫，以淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，部分肺泡壁斷裂、缺損，尤以高劑量組最為明顯。而且低、中、高劑量組大鼠的肺組織病理學(xué)評(píng)分均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1 Comparison of the pathological results between different rat lung groups（HE staining，×100）圖1 大鼠肺組織病理結(jié)果比較（HE染色，×100）

2.3 免疫組化檢測 大鼠肺組織內(nèi)NLRP3在對(duì)照組少量表達(dá)，而低、中、高劑量組大鼠肺組織內(nèi)NLRP3表達(dá)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表1。

2.4 免疫熒光雙染色 對(duì)照組肺巨噬細(xì)胞和NLRP3的熒光強(qiáng)度均較弱，而隨著PM2.5染毒劑量的增加，肺巨噬細(xì)胞和NLRP3的熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)（紅色與綠色熒光融合為橘黃色），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3、4。

2.5 肺組織IL-18、IL-1β及Caspase-1的表達(dá) 與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組大鼠肺組織內(nèi)IL-18、IL-1β及Caspase-1的表達(dá)均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

Tab.1 The effects of PM2.5 on phagocytic function of macrophages in BALF,histopathological scores and cumulative light density(IOD)表1 PM2.5對(duì)大鼠BALF內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能、肺組織病理評(píng)分及IOD的影響 （n=8，±s）

Tab.1 The effects of PM2.5 on phagocytic function of macrophages in BALF,histopathological scores and cumulative light density(IOD)表1 PM2.5對(duì)大鼠BALF內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能、肺組織病理評(píng)分及IOD的影響 （n=8，±s）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較，b與低劑量組比較，c與中劑量組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組F巨噬細(xì)胞的吞噬功能OD值0.622 8±0.068 7 0.516 5±0.061 7a 0.425 4±0.075 3ab 0.380 5±0.076 4ab 18.324＊抑制率（%）-17.07 31.70 38.90肺組織病理評(píng)分（分）0.875±0.641 3.375±1.061a 7.875±1.126ab 12.375±1.506abc 162.479＊NLRP3表達(dá)（IOD）9 773.064±389.333 10 430.403±687.123a 17 170.345±367.243ab 45 336.018±492.150abc 8 998.181＊

Fig.2 The expression of NLRP3 in rat lung by IHC stainning method(×400)圖2 大鼠肺組織NLRP3表達(dá)（免疫組化染色，×400）

Fig.3 Expressions of NLRP3 in rat alveolar macrophages(F4/80)in four groups圖3 各組大鼠肺巨噬細(xì)胞（F4/80）內(nèi)NLRP3的表達(dá)

Fig.5 Expressions of IL-18,IL-1β and Caspase-1 in rat lung in four groups圖5 各組大鼠肺組織內(nèi)IL-18、IL-1β及Caspase-1的表達(dá)

3 討論

PM2.5是指直徑≤2.5μm的大氣細(xì)顆粒物，較易吸附空氣中的有毒有害物質(zhì)（如重金屬、揮發(fā)性有機(jī)化合物和多環(huán)芳烴等），并且在大氣中的滯留時(shí)間長、傳送距離遠(yuǎn)［9-10］。因其既可較長時(shí)間在空氣中停留，又可直接到達(dá)肺泡通過氣血交換入肺入血，故對(duì)肺損傷較大。

AM是由單核細(xì)胞分化而來，廣泛分布于肺泡以及支氣管肺泡上皮表面，是呼吸系統(tǒng)固有免疫的第一道防線，在支氣管和肺泡局部的固有免疫防御及過度免疫導(dǎo)致的炎癥損害等方面發(fā)揮重要的作用［11］。正常狀況下PM2.5進(jìn)入肺泡后，AM立即發(fā)揮吞噬、免疫和分泌作用，對(duì)其及時(shí)進(jìn)行清除。但當(dāng)PM2.5濃度超過一定量后，會(huì)引起一系列生理、生化指標(biāo)的變化，甚至發(fā)生肺損傷，本實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果證實(shí)，大鼠氣管滴注PM2.5染毒后肺損傷明顯（間質(zhì)性肺炎、支氣管周圍炎），表現(xiàn)為肺泡腔增厚，肺泡間隔增寬、斷裂，并伴有以淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤；其次，有研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5可引起Nc/Nga小鼠BALF內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加且IL-1β表達(dá)上調(diào)，從而出現(xiàn)過敏反應(yīng)［12］。本研究也發(fā)現(xiàn)，大鼠氣管滴注PM2.5后BALF內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能下降。

近期研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5可通過上調(diào)NLRP3炎性小體誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥反應(yīng)［13］，但上調(diào)的NLRP3蛋白的細(xì)胞定位尚不明確。因此，一方面筆者采用免疫組織化學(xué)染色法分析大鼠肺組織內(nèi)NLRP3表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠氣管滴注PM2.5造模后肺組織內(nèi)NLRP3表達(dá)均有不同程度的上調(diào)；另一方面采用FITC標(biāo)記肺泡巨噬細(xì)胞，Cy3標(biāo)記NLRP3蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)PM2.5染毒后肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，并隨PM2.5的劑量升高而表達(dá)上調(diào)。這表明，PM2.5引起的大鼠肺損傷與肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體活化密切相關(guān)。

NLRP3炎性小體為NLRP3與接頭蛋白ASC和效應(yīng)蛋白Caspase-1組裝形成一種分子質(zhì)量約為700 ku的大分子多蛋白復(fù)合體，可激活Caspase-1（即IL-1β轉(zhuǎn)化酶），進(jìn)而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-18和IL-1β的剪切成熟和分泌，引起系列炎癥反應(yīng)。因IL-18和IL-1β處于免疫反應(yīng)的上游，能刺激多種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，如其生成過多可引起一系列炎癥性疾病［14-15］。因此，對(duì)NLRP3炎性小體及其下游信號(hào)通路IL-18和IL-1β進(jìn)行深入的研究，可對(duì)相關(guān)的炎癥性疾病的防治提供新的策略和臨床應(yīng)用的理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)利用ELISA法檢測肺組織勻漿內(nèi)IL-18、IL-1β和Caspase-1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織內(nèi)IL-18、IL-1β及Caspase-1的表達(dá)均明顯上調(diào)。這表明，PM2.5引起的肺損傷是由于肺巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體活化，進(jìn)而引起IL-1β和IL-18的活性釋放而造成的。

目前，PM2.5肺損傷的發(fā)病機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過氣管滴注PM2.5制作大鼠肺損傷模型，利用肺組織病理評(píng)分、免疫組化、免疫熒光雙染色及ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)大鼠肺損傷與肺巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體活化密切相關(guān)。接下來，驗(yàn)證該通路引起的固有免疫反應(yīng)是筆者研究的重點(diǎn)。

（圖4見插頁）