牛連杰，張雅敏，武兆國(guó)

肝細(xì)胞癌（HCC）是第六大致命惡性腫瘤，在全球癌癥相關(guān)死亡中位居死亡率第三位［1］。microRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的短鏈非編碼RNA，可通過(guò)降解mRNA或抑制mRNA翻譯，調(diào)控眾多基因的表達(dá)，在胚胎的發(fā)生、組織器官發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)分化與凋亡、疾病發(fā)生和發(fā)展等生命活動(dòng)中起重要作用［2］。miRNAs與肝癌密切相關(guān)，特定miRNA在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用正成為肝癌研究的新熱點(diǎn)，miRNAs有望成為肝癌治療的新靶點(diǎn)［3］。本研究通過(guò)在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-155，檢測(cè)miR-155對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及儀器 人肝癌細(xì)胞系HepG2由南開(kāi)大學(xué)器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清、低糖培養(yǎng)基（Gibco公司）；Trizol及Lipo2000試劑（Invitrogen公司），帶熒光標(biāo)記和嘌呤霉素篩選的miR-155 hRNA質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒（復(fù)能基因，廣州）；引物合成由天津華大生物公司完成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量PCR用SYBR Green染料（全式金生物公司，北京），PTEN抗體（萬(wàn)類生物，沈陽(yáng)），CyclinD1和CyclinA1+A2（Abcam公司，美國(guó)），CCK-8試劑（博士得生物公司，武漢）。Real-time PCR儀：LightCycler?480（羅氏公司，瑞士），熒光顯微鏡（奧林巴斯公司，日本），CO2培養(yǎng)箱（賽默飛公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的提取和病毒包裝 質(zhì)粒的提?。撼墒熨|(zhì)粒轉(zhuǎn)化50μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液搖床過(guò)夜（12～16 h），按照無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)（康為世紀(jì)，北京）提取質(zhì)粒。慢病毒的包裝及病毒滴度測(cè)定按照文獻(xiàn)［4］方法進(jìn)行。

1.2.2 HepG2的分組及轉(zhuǎn)染 試驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組（N組）即未做任何處理；干擾組（過(guò)表達(dá)miRNA-155，H組），即上調(diào)HepG2細(xì)胞中的miR-155；陰性對(duì)照組（negative control，NC組），即轉(zhuǎn)染空病毒。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞按照上述分組轉(zhuǎn)染，24 h后換液，48 h后換新鮮培養(yǎng)基，加1 g/L的嘌呤霉素，每24 h更換新鮮培養(yǎng)基，直至未做任何處理的細(xì)胞全部死亡，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞miR-155和PTEN mRNA表達(dá) 分組及操作如1.2.2所述，兩個(gè)6孔板同時(shí)操作。慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，采用qRT-PCR檢測(cè)miR-155及PTEN的表達(dá)水平，判斷轉(zhuǎn)染效果。miR-155和PTEN引物序列見(jiàn)表1。以各自的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄特異性引物，均由天津華大生物公司合成。按說(shuō)明書(shū)配制PCR體系。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火、延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本均檢測(cè)4次，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算miRNA-155和PTEN相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，10%SDS-PAG電泳，320 mA、90 min冰浴轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗于4℃冰箱過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，顯影曝光觀察相對(duì)表達(dá)情況。

Tab.1 Sequence of each gene primer表1 各基因引物序列

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 收集各組細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，以每孔2×107/L的密度接種于96孔板，培養(yǎng)0、12、24、48和72 h后分別進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2 h，檢測(cè)波長(zhǎng)在450 nm處吸光度（OD）值，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒滴度測(cè)定 miR-155-hRNA-LV和NEGGFP-LV均為2×109TU/mL。

2.2 轉(zhuǎn)染效率及miR-155、靶基因PTEN相對(duì)表達(dá)量 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，H組和NC組兩者均大于90%，見(jiàn)圖1。H組miR-155表達(dá)量明顯高于NC組及N組，靶基因PTEN的表達(dá)量低于NC組及N組（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

Fig.1 Results of fluorescence microscopy of virus infected HepG2 cells（×100）圖1 熒光顯微鏡觀察病毒感染HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（×100）

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果 H組PTEN的表達(dá)量明顯低于NC組和N組，而CyclinD1、CyclingA1+A2的表達(dá)量明顯高于NC組和N組（均P＜0.05），見(jiàn)圖2、表3。

Tab.2 Relative expression levels of microRNA-155 and PTEN after transfection表2 轉(zhuǎn)染后各組microRNA-155和PTEN相對(duì)表達(dá)量（n=4，±s）

Tab.2 Relative expression levels of microRNA-155 and PTEN after transfection表2 轉(zhuǎn)染后各組microRNA-155和PTEN相對(duì)表達(dá)量（n=4，±s）

＊＊P＜0.01：a與N組比較，b與NC組比較，均P＜0.05

組別N組NC組H組F miR-155 1.030±0.065 1.011±0.022 1.583±0.035ab 161.400＊＊PTEN 0.993±0.011 0.986±0.023 0.653±0.029ab 226.600＊＊

Fig.2 Results of PTEN,CyclinD1,and CyclingA1+A2 detected by Western blot assay in three groups圖2 各組Western blot檢測(cè)PTEN、CyclinD1、CyclingA1+A2結(jié)果

Tab.3 Relative gray scale of Western blot assay in three groups表3 各組蛋白Western blot相對(duì)灰度值 （n=3，±s）

Tab.3 Relative gray scale of Western blot assay in three groups表3 各組蛋白Western blot相對(duì)灰度值 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01：a與N組比較，b與NC組比較，均P＜0.05

組別N組NC組H組F PTEN 0.878±0.022 0.889±0.017 0.356±0.022ab 687.237＊＊CyclinD1 0.399±0.008 0.389±0.019 0.660±0.040ab 107.527＊＊CyclinA1+A2 1.092±0.027 1.065±0.025 1.643±0.063ab 177.817＊＊

2.4 各組CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 3組12 h時(shí)OD值開(kāi)始出現(xiàn)差異，24、48、72 h時(shí)H組OD值均大于NC組和N組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

3 討論

miRNAs與肝癌密切相關(guān)，研究特定miRNAs在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用正成為肝癌研究新熱點(diǎn)［5］。miR-155作為miRNAs家族一員，是一種多功能microRNA。大量研究證實(shí)，miR-155在免疫應(yīng)答、自身免疫性疾病和心血管系統(tǒng)疾病等免疫炎癥性疾病，以及各種腫瘤（膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、白血病、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌和肝癌）中發(fā)揮重要作用［6］。miR-155可在翻譯水平靶向調(diào)控MyD88的表達(dá)，從而抑制免疫炎癥反應(yīng)［7］。目前，miR-155可通過(guò)阻止上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程和ERK1信號(hào)通路，從而減弱肝星狀細(xì)胞的活化［8］。另有研究顯示，miR-155通過(guò)靶向ARID2介導(dǎo)的Akt磷酸化通路促進(jìn)肝癌腫瘤生長(zhǎng)，并可能作為一種新的肝癌預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［9］。因此，miR-155在疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用以及具體機(jī)制可能具有多樣性。

目前，有關(guān)建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的miR-155的肝癌細(xì)胞系的相關(guān)研究較少。本研究利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-155的HepG2細(xì)胞，從不同水平檢測(cè)細(xì)胞增殖水平的變化。本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了miR-155慢病毒表達(dá)載體。qRT-PCR結(jié)果表明，miR-155可抑制PTEN基因的表達(dá)而促進(jìn)了細(xì)胞增殖；Western blot結(jié)果表明H組PTEN的表達(dá)量明顯低于NC組和N組，而CyclinD1、CyclinA1+A2的表達(dá)量明顯高于NC組和N組，CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明12 h時(shí)3組OD值開(kāi)始出現(xiàn)差異，24 h后H組OD值均大于NC組和N組，表明從基因水平、蛋白水平和細(xì)胞水平變化均證實(shí)了miR-155具有顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的作用。因此，筆者認(rèn)為miRNA-155在調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，miR-155表達(dá)上調(diào)使PTEN基因的表達(dá)下調(diào)，但CyclinD1、CyclinA1+A2的表達(dá)增加說(shuō)明miR-155對(duì)細(xì)胞生物學(xué)水平的調(diào)控不止一種信號(hào)通路，但具體的作用機(jī)制和信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-155與肝癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，miR-155具有癌基因樣功能，可能是肝癌相關(guān)miRNA編碼基因。miR-155也許能夠成為患者早期診斷、治療方案選擇的分子標(biāo)志物。這為臨床研究miR-155信號(hào)通路抑制劑提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Tab.4 Comparison of relative OD by CCK-8 assay between three groups表4 各組CCK-8檢測(cè)OD值比較 （n=3，OD值，±s）

Tab.4 Comparison of relative OD by CCK-8 assay between three groups表4 各組CCK-8檢測(cè)OD值比較 （n=3，OD值，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01：a與N組比較，b與NC組比較，均P＜0.05

組別N組NC組H組F 72 h 0.985±0.022 0.958±0.022 1.577±0.028ab 598.500＊＊0 h 0.230±0.007 0.230±0.011 0.235±0.006 0.342 12 h 0.264±0.009 0.270±0.009 0.302±0.011ab 13.080＊＊24 h 0.375±0.006 0.368±0.007 0.592±0.008ab 929.300＊＊48 h 0.720±0.012 0.730±0.011 1.164±0.057ab 165.900＊＊