陳枕枕, 牛昱宇

昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 昆明 650500

帕金森病(PD)是一種神經(jīng)退行性疾病，患者在晚期階段伴隨靜止震顫、身體僵硬、運動障礙等運動性退化癥狀。其主要病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)(substantial nigra, SN)中多巴胺能神經(jīng)元(DAns)功能異常。然而，人們對于PD發(fā)病機制的認識和有效的治療手段研究還十分有限，主要原因是缺乏有效的研究模型。

誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)是類似于胚胎干細胞(embryonic stem cell, ESCs)且具有自我更新和分化潛能的一種干細胞。2006年，Takahashi等[1]在前人研究基礎(chǔ)上利用病毒載體將4個轉(zhuǎn)錄因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)轉(zhuǎn)入體細胞中，使其重編程為一種多能干細胞。次年，Takahashi等[2]又使用類似的方法成功獲得了由人的體細胞得到的iPSCs。隨著研究的深入，研究人員也得到了非病毒誘導(dǎo)處理得到的iPSCs[3]，為iPSCs在基礎(chǔ)和臨床研究方面奠定了基礎(chǔ)。

雖然以小鼠為代表的PD動物模型已得到廣泛應(yīng)用，但仍存在諸多不足：無法體外直接觀察；不能重復(fù)DAns的變化、路易小體的形成和神經(jīng)突損失的完整過程；PD患者的尸檢僅能觀察到最終狀態(tài)，而不能重現(xiàn)其發(fā)病過程。因此，尋找新的能如實反映PD患者發(fā)病過程的模型成為研究PD發(fā)病機制的關(guān)鍵所在。而來源于患者的iPSCs恰好可以彌補動物模型的不足：方便體外觀察；能夠完整重現(xiàn)DAns形態(tài)功能異常、內(nèi)部變化的過程；便于控制由環(huán)境、動物個體差異等因素帶來的干擾，是模擬PD發(fā)生的病理固有特征和細胞水平PD研究的最佳選擇。此外，基于iPSCs的自體細胞移植治療也是近年來研究的熱門話題。本文將從iPSCs細胞模型、自體細胞移植治療PD等方面介紹iPSCs在PD研究中的進展，以期為PD的相關(guān)研究提供參考。

1 iPSCs與PD細胞模型

研究人員用單基因異常的iPSCs逐步誘導(dǎo)神經(jīng)祖/干細胞及各類成熟神經(jīng)元(如DAns、DA前體細胞和星形膠質(zhì)細胞等)，通過控制變量來觀察該基因?qū)ι窠?jīng)元發(fā)育、病變的影響，因此可用iPSCs細胞模型來研究單基因與PD發(fā)病的關(guān)系，從而了解PD的發(fā)病機制。用來研究PD發(fā)病機制的iPSCs模型主要有LRRK2突變、PINK1突變、α-synuclein突變、Parkin突變、GBA突變等類型，科學(xué)家們正是從這些細胞模型的研究中揭示PD發(fā)病的機制。

1.1 LRRK2突變

LRRK2突變主要包括N1437H、R1441C、G2019S 3個位點的突變，其中G2019S是最常見的一種[4]。研究人員在G2019S-iPSC衍生的DAns中發(fā)現(xiàn)并報道了氧化應(yīng)激、SNCA蛋白積聚、線粒體自噬和DNA受損的現(xiàn)象，與正常DAns相比，G2019S-iPSC衍生的DAns對氧化應(yīng)激和蛋白酶體應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡更敏感，這些細胞經(jīng)長期培養(yǎng)后，SNCA蛋白的表達水平明顯升高[5,6]。除了氧化應(yīng)激和SNCA蛋白質(zhì)累積現(xiàn)象外，在這些DAns中還可以看到神經(jīng)突數(shù)目和分支減少等現(xiàn)象[7]，而氧化應(yīng)激、SNCA蛋白積聚、線粒體自噬以及DNA損傷都是PD的典型病理學(xué)特征[8]。

1.2 PINK1突變

PINK1編碼線粒體靶向激酶，可以保護神經(jīng)元免受應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體功能障礙[9]。2011年，Seibler等[10]通過PINK1-iPSC誘導(dǎo)的DAns發(fā)現(xiàn)了線粒體去極化、拷貝數(shù)增加和PGC-1表達上調(diào)等現(xiàn)象。Rakovic等[11]證實，來自PINK1-iPSC的Parkin蛋白表達水平降低，并且由于泛素化功能障礙導(dǎo)致線粒體膜電位喪失而引起間質(zhì)性浸潤，這表明PINK1可能與線粒體損傷有關(guān)。更重要的是，在這些DAns中通過慢病毒轉(zhuǎn)染使其表達PINK1，能夠恢復(fù)由于Parkin基因缺陷引起的線粒體易位，進一步驗證了PINK1和Parkin的協(xié)同作用[12,13]。

1.3 α-synuclein突變

α-synuclein是路易小體的主要成分，也存在于SNCA三倍體患者的DAns中[14]。2011年，Devine和Byers報道稱，突觸核蛋白三倍體(AST)患者和正常人SNCA蛋白的表達量沒有差異。但分化成DAns時，與正常神經(jīng)元相比，AST神經(jīng)元中SNCA蛋白的數(shù)量增加了1倍，并且AST神經(jīng)元對氧化應(yīng)激更敏感，進一步證實了SNCA蛋白積累和氧化應(yīng)激在PD中的重要作用[15,16]。

1.4 Parkin突變

Parkin編碼三亞基連接酶復(fù)合物的組成部分，其介導(dǎo)底物蛋白質(zhì)靶向蛋白酶體降解。它除了與PINK1在線粒體損傷和氧化應(yīng)激中的協(xié)同作用外，也與DA的內(nèi)平衡有關(guān)，來自PD患者iPSC衍生的DAns表現(xiàn)出DA吸收降低、釋放增加的現(xiàn)象。由于線粒體功能障礙，這些DAns中的活性氧水平也有所提高，這表明Parkin蛋白可以提高DAns神經(jīng)傳遞的準確性，抑制DA氧化[17,18]，對神經(jīng)元損傷具有保護作用[19]。

1.5 GBA突變

GBA基因編碼溶酶體膜蛋白β-葡萄糖腦苷脂酶(也稱為酸性β-葡糖苷酶)，其突變會導(dǎo)致糖脂底物在溶酶體中積累。葡萄糖腦苷脂酶抗體和溶酶體功能障礙被認為是PD的重要致病機制[20]。2012年，Panicker等報道，GBA-iPSC衍生DAns顯示出SNCA基因高表達，并且由于葡萄糖腦苷脂酶(GCase)缺陷，大鼠噬菌體的清除能力下降[21,22]。

這些細胞模型在體外模擬PD患者的發(fā)病過程，直觀地反應(yīng)細胞之間的聯(lián)系、功能損傷直至完全壞死的過程，但也有其不足之處。目前培養(yǎng)細胞一般是貼壁培養(yǎng)，但細胞在機體內(nèi)部相互之間聯(lián)系的緊密程度遠遠超過培養(yǎng)皿中的情況，所以細胞培養(yǎng)過程中所表現(xiàn)出的聯(lián)系程度遠遠不夠，還需要更為立體的模型來解決這一問題，如3D培養(yǎng)技術(shù)、類腦體的研究等。

2 iPSCs與PD細胞治療

目前PD的治療方法主要分為三大類：藥物治療、手術(shù)治療和細胞治療。藥物治療以左旋多巴類藥物為主，這種治療方法雖然在前期治療中效果顯著，但隨著時間的推移，其效果會隨耐藥性的產(chǎn)生逐漸降低甚至消失，且對患者有很大副作用。手術(shù)治療適用于藥物治療效果不好、病情難以控制的PD患者，但由于風(fēng)險大、費用昂貴、治療效果無法保證，因而許多患者無法接受。由于受損細胞種類單一，又分布在特定的局限空間，這些發(fā)病特點又為細胞治療提供了先天條件。

2.1 iPSCs技術(shù)與自體細胞移植

自體細胞移植(圖1)是采用病人來源于自身的細胞經(jīng)過體外分化、基因編輯、移植的過程用于疾病治療的一種手段。目前研究中用于治療的干細胞主要包括胚胎干細胞、iPSCs、神經(jīng)干細胞和間充質(zhì)干細胞，在治療的過程中不同類型的干細胞展現(xiàn)出了各自的優(yōu)劣，相比較于其他幾類干細胞，iPSCs的來源最為方便、安全，且分化潛能僅次于胚胎干細胞，因此成為細胞治療的首選。

圖1 自體細胞移植示意圖Fig.1 Transplanting diagram of autologous cells.

Yoshikawa等[23]在大鼠PD模型中的細胞移植實驗有力地支持了自體移植的可行性及治療效果等問題，為一些神經(jīng)系統(tǒng)功能性損傷及缺失疾病的治療帶來了希望。類似的，中國科學(xué)家將獼猴iPSCs誘導(dǎo)出的DAns移植入藥物模型猴體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其癥狀得到了明顯改善[24]。2017年，日本科學(xué)家在前人的實驗基礎(chǔ)上，分別使用健康人和PD患者(非基因突變)iPSC誘導(dǎo)的DA前體細胞移植入PD猴模型腦內(nèi)，并進行了長達兩年的觀察，發(fā)現(xiàn)這些細胞成功地在模型猴體內(nèi)存活、增殖并發(fā)揮正常功能，沒有發(fā)現(xiàn)致瘤現(xiàn)象，成功緩解了模型猴的癥狀，并發(fā)現(xiàn)PD患者與健康人來源的iPSCs同樣具有治療效果[25]。也就是說，對于非基因突變型患者而言，不需要經(jīng)過體外修復(fù)過程，就可以達到治療效果。而對于家族性PD患者，則需要通過體外基因編輯對突變基因進行修飾，才可以得到具有正常功能的DAns，達到細胞治療的效果。

雖然細胞移植治療PD是比較理想的方法，但也存在諸多不足。首先，在體內(nèi)分化的DAns是否會因為基因異常而無法正常發(fā)揮功能，這需要對基因突變型患者來源的iPSCs進行體外基因修復(fù)，然后再誘導(dǎo)分化移植回病人體內(nèi)，但基因修復(fù)過程中會不會引入其他突變，這也是一個懸而未決的問題。其次，人體是一個綜合復(fù)雜的系統(tǒng)，不同細胞類型之間的聯(lián)系密不可分，雖然iPSCs可以建立PD細胞模型，但是無法顯示其移植后與其他類型細胞相互作用的情況。再次，如何確定移植物的存活、增殖以及是否發(fā)揮正常功能。已有研究使用影像學(xué)結(jié)合同位素示蹤的方法來追蹤移植物的生存狀況[25]，但該方法還處于探索階段，其準確性、時效性還有待提高，距離臨床應(yīng)用還有很長一段路要走。

2.2 細胞自體移植存在的問題

2.2.1細胞來源 最初的iPSCs是通過病毒導(dǎo)入4個多能性基因來實現(xiàn)的，其中包括致癌基因c-Myc，但致癌基因的重新啟動對于臨床治療來說是一個潛在的風(fēng)險，科學(xué)家們?yōu)榇艘哺冻隽舜罅颗υ噲D避開致癌基因的使用。2009年，Lin等[26]通過SB43125 和PD0325901兩個化學(xué)小分子得到了人iPSCs，這解決了人們擔(dān)心的細胞來源安全性的問題。之后，小分子重編程體系也不斷完善，更多的小分子被用于重編程中，如Forskolin、CHIR99021、DZNep、RepSox[27]等抑制信號通路型小分子，以及Staerk[28]發(fā)現(xiàn)的SOX2替代物RepSox 616452、LY-364947、Dasatinib、iPYrazine、PP1等。2015年，Li等[29]用ISX9、I-BET151、CHIR99021、Forskolin 4個小分子將小鼠的成纖維細胞轉(zhuǎn)分化得到神經(jīng)元。同年，Hu等[30]也通過ValproicAcid、CHIR99021、RepSox、Forskolin化學(xué)小分子將阿爾茲海默患者的成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。

雖然目前還沒有報道研究化學(xué)方法誘導(dǎo)的DAns，但在未來細胞移植中，化學(xué)來源的細胞(如DAns、DA前體細胞、NSCs等)致癌風(fēng)險小，且小分子容易被細胞代謝，是目前已知多種細胞來源里面最為安全的，但DAns的誘導(dǎo)還需更多的研究來實現(xiàn)。

2.2.2細胞功能 對于家族性PD患者來說，其發(fā)病主要是基因突變引起的，因此，通過體外基因編輯技術(shù)糾正患者突變基因的表達，得到正常的DAns/DA前體細胞也是細胞治療的關(guān)鍵。

近年來，以鋅指核酸酶類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)、鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)以及規(guī)律重復(fù)短回文序列簇(clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat, CRISPR)為主的基因編輯技術(shù)不僅成功應(yīng)用于斑馬魚[31,32]、嚙齒類[33,34]以及非人靈長類[35,36]等模式動物中，還廣泛應(yīng)用于iPSCs的修飾，用于得到基因突變的細胞模型[37,38]、修飾異?；虻谋磉_[39～41]等方面。這些研究的順利進行使得體外修飾患者異?；虮磉_成為可能，也為臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

綜上所述，得到非癌變DAns/DA前體細胞，并通過基因編輯技術(shù)修飾其突變基因，才可以使iPSCs的應(yīng)用真正離臨床治療更進一步。

3 展望

雖然目前的研究發(fā)現(xiàn)已經(jīng)取得了很多成果，但是由于PD的發(fā)病機制非常復(fù)雜并且尚不完全清楚，所以在PD的治療中，僅依靠iPSCs是非常局限的，必須要與其他生物技術(shù)相結(jié)合，如基因編輯技術(shù)、細胞移植技術(shù)等。細胞移植技術(shù)的迅猛發(fā)展也為PD的治療提供了解決之道，并且在某些疾病研究領(lǐng)域也獲得了重大發(fā)現(xiàn)與發(fā)展[42]。但是PD的病理進程錯綜復(fù)雜，給臨床應(yīng)用帶來了很大阻力。一方面，iPSCs或由其衍生而來的神經(jīng)細胞移植到患者體內(nèi)后的存活、生長、遷移及是否發(fā)揮功能仍有待研究；另一方面，移植到病患體內(nèi)的細胞的安全性更需通過各類動物模型來進行更深層次的研究。