劉 丹，楊曉波，王 穎，于麗紅，石 焱，張英杰，周 琳，石 磊

(1.解放軍第210醫(yī)院藥劑科，遼寧 大連 116021；2.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，遼寧 大連 116021)

紅細(xì)胞數(shù)量巨大，具有天然免疫功能，是重要的固有免疫細(xì)胞，具有識別、黏附、濃縮和殺傷抗原的能力[1]?；熦氀腔熀蟪Ｒ姷母弊饔弥?，會使患者感到氣短、虛弱、眩暈、眼花和明顯的乏力[2]。沈穎等[3]研究生三七對IgA腎病患者紅細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用的結(jié)果表明：IgA腎病患者存在紅細(xì)胞免疫功能低下，生三七對改善IgA腎病紅細(xì)胞免疫有積極作用。四物湯是常用的補(bǔ)血方劑，具有補(bǔ)血活血作用，四物湯對紅細(xì)胞免疫影響的研究[4-5]結(jié)果顯示四物湯有較明顯的增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫功能的作用。但目前未見對紅細(xì)胞免疫機(jī)制進(jìn)行研究的相關(guān)報(bào)道。本研究采用5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的C57小鼠作為貧血動物模型，探討四物湯對紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白水平以及紅細(xì)胞表面抗體的影響，為四物湯治療化療貧血提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑和儀器 24只C57BL/6N小鼠，雄性，11周齡， SPF級(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)，動物許可證編號：SCXK京2016-0006。FITC-CD71(Biolegend，美國)，PE-Ter119抗體(上海潤成生物科技有限公司，中國 )，紅細(xì)胞裂解液(蘇州賽特生物醫(yī)藥科技有限公司，中國)，肝素(北京亞米生物科技有限公司，中國)，5-氟尿嘧啶注射液(解放軍第210醫(yī)院，中國)，當(dāng)歸、白芍、熟地和川芎(同仁堂藥店，中國)。FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson 公司，美國)，全自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(琪摩上海電子科技有限公司，中國)。

1.2 四物湯的制備[6-8]四物湯由當(dāng)歸、白芍、熟地和川芎組成，處方為：當(dāng)歸10 g，白芍12 g，熟地12 g，川芎8 g。熬制湯藥，減壓蒸發(fā)制成干浸膏。采用生理鹽水溶解制成濃度為300 g·L-1四物湯樣品，備用。

1.3 動物飼養(yǎng)、分組和給藥 健康靈活C57小鼠在SPF級無菌條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)期間控制室溫為(20±2)℃，12 h交替照明。C57小鼠飲用水以及其飼料均為無菌，實(shí)驗(yàn)操作均在超凈臺內(nèi)完成，保證環(huán)境處于無菌狀態(tài)。小鼠飼養(yǎng)在1個(gè)籠子適應(yīng)環(huán)境1周后，將小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和四物湯組，每組8只。對照組：未給藥；模型組：5-氟尿嘧啶(150 mg·kg-1)靜脈注射，注射15 d，每天注射1次，每次0.2 mL，于第3、7、9、12和15天尾靜脈取血，加入含有抗凝劑的試管中，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。四物湯組：5-氟尿嘧啶(150 mg·kg-1)靜脈注射，注射7 d，每天注射1次，每次0.2 mL，于第3和7天尾靜脈取血，加入含有抗凝劑的試管中用于細(xì)胞計(jì)數(shù)；然后灌胃四物湯(300 g·L-1)每天1次，每次0.5 mL，于第9、12和15天尾靜脈取血，加入含有抗凝劑的試管中，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。15 d后，收集血液并采取安樂死方法處死小鼠，行尸體解剖，收集脾臟，備用。

1.4 顯微鏡觀察各組小鼠紅細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn) 給藥第15天時(shí)取各組小鼠外周血1滴，滴于載玻片上，制成血涂片，染色，顯微鏡觀察各組小鼠紅細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 各組小鼠外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白水平 給藥第15天時(shí)取各組小鼠外周血60 μL，加入含有肝素的試管中，充分混合后，采用全自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測小鼠外周血中紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白水平。計(jì)算各組小鼠單位體積內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白水平。 C=A(540)HiCN×367.7，A(540)HiCN為測定管的吸光度(A)值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠外周血標(biāo)記的紅細(xì)胞數(shù) 取外周血，加入含有抗凝劑的試管中，紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，離心，棄上清，加入PBS洗滌2次， 離心，棄上清，收集細(xì)胞。參照說明書加入FITC-Ter119標(biāo)記抗體和PE-CD71抗體[9]，室溫避光孵育20 min，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入2 mL PBS 洗滌2次，加入250 μL PBS上機(jī)檢測，采用流式細(xì)胞儀分析各組小鼠外周血標(biāo)記的紅細(xì)胞數(shù)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟標(biāo)記的紅細(xì)胞數(shù) 取小鼠脾臟，迅速磨碎，獲取單細(xì)胞懸液，加入紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，離心，棄上清，加入PBS洗滌2次， 離心，棄上清，收集細(xì)胞。參照說明書[9]加入FITC-Ter119標(biāo)記抗體和PE-CD71抗體，室溫避光孵育20 min，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入2 mL PBS 洗滌2次，加入250 μL PBS上機(jī)檢測，采用流式細(xì)胞儀分析各組小鼠脾臟標(biāo)記的紅細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠紅細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn) 與對照組比較，模型組小鼠紅細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞皺縮；與模型組比較，四物湯組小鼠紅細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞變圓。見圖1(插頁一)。

2.2 各組小鼠外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù) 與對照組比較，給藥第9、12和15天模型組小鼠外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，給藥第15天四物湯組小鼠外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)

Group Count of red cells in peripheral blood (t/d) 0 3 7 9 12 15 Control8.19±1.248.23±1.238.15±1.098.16±1.258.18±1.168.25±1.56Model8.26±1.167.95±0.987.19±1.126.79±0.89*6.58±0.86*6.43±0.98Siwutang8.21±1.137.86±1.157.08±1.037.15±0.987.68±0.967.99±1.07*△

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group.

2.3 各組小鼠外周血血紅蛋白水平 與對照組比較，給藥第15天模型組小鼠血紅蛋白水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，給藥第15天四物湯組小鼠血紅蛋白水平明顯升高(P<0.01)。見表2。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠外周血血紅蛋白水平

Group Hemoglobin level(t/d) 0 3 7 9 12 15 Control 154.9±19.8155.3±20.6145.3±19.5146.8±18.6 154.3±18.3155.8±20.8 Model152.3±19.5 144.8±20.4135.9±18.5 128.4±17.6 124.6±16.8*119.6±15.6*Siwutang153.5±20.3145.6±20.8 137.8±19.6 140.5±18.5 142.6±19.5 145.3±17.2△

*P<0.01vscontrol group;△P<0.05vsmodel group.

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠外周血標(biāo)記的紅細(xì)胞數(shù) 與對照組比較，模型組小鼠外周血CD71/Ter119表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。模型組UL象限紅細(xì)胞數(shù)量(2.15%)低于對照組(6.95%)(P<0.01)，UR象限紅細(xì)胞數(shù)量(0.97%)低于對照組(11.34%)(P<0.01)，LR象限紅細(xì)胞數(shù)量(2.64%)低于對照組(21.32%)(P<0.01)。與模型組比較，四物湯組小鼠外周血CD71/Ter119表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；四物湯組UL象限紅細(xì)胞數(shù)量(3.72%)高于模型組(2.15%)(P<0.01)，UR象限紅細(xì)胞數(shù)量(8.95%)高于模型組(0.97%)(P<0.01)，LR象限紅細(xì)胞數(shù)量(16.31%)高于模型組(2.64%)(P<0.01)。見圖2。

A:Diagram of flow cytometry;B:Histogram.

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟標(biāo)記的紅細(xì)胞數(shù) 與對照組比較，模型組小鼠脾臟血CD71/Ter119表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，UL、UR和LR象限紅細(xì)胞數(shù)量低于對照組(P<0.01)；與模型組比較，四物湯組小鼠脾臟血CD71/Ter119表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，UL象限紅細(xì)胞數(shù)量降低(P<0.01)，UR和LR象限紅細(xì)胞數(shù)量升高(P<0.01)。見圖3。

A:Diagram of flow cytometry;B:Histogram.

3 討 論

紅細(xì)胞是人體中最多的一類細(xì)胞，主要生理功能是通過細(xì)胞中所含的血紅蛋白進(jìn)行氧與二氧化碳交換。每天都有許多紅細(xì)胞因衰老而死亡，另外又有許多新生的紅細(xì)胞取代衰老的紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞數(shù)量保持動態(tài)平衡，以保持身體新陳代謝的正常需要，但是化療會造成紅細(xì)胞生成和破壞的平衡失調(diào)，使紅細(xì)胞數(shù)量減少，從而引起貧血[10-11]。

本研究采用全自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測外周血紅細(xì)胞數(shù)量變化的結(jié)果表明：與對照組比較，模型組小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)量明顯降低；與模型組比較，四物湯組小鼠紅細(xì)胞數(shù)量明顯升高。采用全自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測外周血血紅蛋白水平的結(jié)果表明：與對照組比較，模型組小鼠外周血血紅蛋白水平明顯降低；與模型組比較，四物湯組小鼠外周血紅蛋白水平明顯升高。紅細(xì)胞膜表面存在大量的免疫相關(guān)分子[12-14]，CD71/Ter119是紅細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物[15]，本研究采用熒光標(biāo)記的CD71/Ter119抗體，進(jìn)行紅細(xì)胞標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。本研究結(jié)果表明：與對照組比較，模型組小鼠外周血CD71/Ter119表達(dá)水平明顯降低；與模型組比較，四物湯組小鼠外周血CD71/Ter119表達(dá)水平明顯升高。取小鼠脾臟進(jìn)行脾臟血CD71/Ter119表達(dá)水平檢測的結(jié)果表明：與對照組比較，模型組小鼠脾臟血CD71/Ter119表達(dá)水平明顯降低；與模型組比較，四物湯組小鼠脾臟血CD71/Ter119表達(dá)水平明顯升高。紅細(xì)胞來源于骨髓造血干細(xì)胞，與骨髓干細(xì)胞的增殖分化有密切關(guān)聯(lián)[16-18]。本研究結(jié)果顯示四物湯對化療所致貧血有恢復(fù)作用，提示四物湯對造血功能恢復(fù)有重要作用，可用于癌癥患者放化療之后骨髓造血功能恢復(fù)的輔助治療，四物湯也可通過增加紅細(xì)胞數(shù)目增強(qiáng)患者的紅細(xì)胞免疫功能。

綜上所述，四物湯對化療后貧血小鼠紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)及免疫功能有較好的調(diào)節(jié)作用，可以改善并恢復(fù)化療貧血小鼠紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白水平，同時(shí)通過雙標(biāo)記抗體CD71/Ter119染色確定了四物湯增加紅細(xì)胞數(shù)量的機(jī)制。本研究結(jié)果提示四物湯可以作為治療化療貧血的中藥應(yīng)用。