朱旭蓉，燕玉娥，狄政莉，王天仲，何 芳，王新來，高曉宇，鄭雪嬌

(1. 陜西省西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安710003；2. 延安大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，陜西 延安716000)

卒中引起的死亡占全世界死亡原因的9%，是僅次于心臟疾病的第二大死亡原因，是造成永久性殘疾的主要因素[1-2]。隨著我國人口老齡化的不斷加劇，卒中發(fā)病率也日益增多。卒中分為缺血性卒中和出血性卒中，其中缺血性卒中占卒中總數(shù)的85%以上。既往研究[3]顯示：缺血/再灌注損傷是其損傷機制之一，但其具體機制及干預靶點尚不清楚，因此探討卒中確切分子機制及有效的治療靶點已成為國內(nèi)外面臨的重大挑戰(zhàn)。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非編碼RNA，其長度為20 ～ 22 bp，通過與其靶mRNA分子的3′端非編碼區(qū)域互補配對,從而使靶mRNA分子在翻譯水平受到抑制或直接導致其降解，進而參與調(diào)控細胞生長分化、能量代謝和細胞凋亡等各個重要而基本的細胞生理過程[4]。miRNA 與多種疾病有關(guān)，其與腦血管疾病也密不可分。miR-155是miRNA 家族的一員，具有miRNA 功能，參與了腫瘤、炎癥反應和心肌梗死等疾病的發(fā)生發(fā)展。既往研究[5]提示腦缺血后miR-155表達可能存在變化，但其在腦缺血/再灌注損傷中確切變化情況尚未得到證實。本研究觀察在急性腦缺血/再灌注損傷大鼠大腦皮層組織中 miRNA-155表達的變化，為進一步探討miRNA-155在腦缺血/再灌注損傷中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器 48 只健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量250 ～ 280 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCHK(陜)2018-001。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購自美國Sigma公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司,TaqMan○RMicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan 探針TaqMan○RMicroRNA Assays和TaqMan○RUniversal PCR Master Mix Ⅱ with UNG購自美國Applied Biosystems公司。NanoDrop○RND-1000紫外分光光度儀購自美國 Thermo公司，qRT-PCR 儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 動物分組和給藥 48只大鼠隨機分為假手術(shù)組(大鼠只分離血管)和腦缺血/再灌注組(大鼠缺血90 min后再進行復灌注)；將2組大鼠分別再分為3個亞組，即再灌注24、48和72 h組，每組8只。

1.3 大鼠腦缺血/再灌注模型建立 所有SD大鼠在恒溫動物房中適應3 d，12 h晝夜交替，自由飲食，避免不良刺激。術(shù)前禁食12 h,自由飲水，采用10%水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉后固定在實驗臺上。參照Ji等[6]改良線栓法栓塞大鼠右側(cè)大腦中動脈制作腦缺血/再灌注模型。在大鼠頸正中部做切口，暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，在動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，在頸總動脈分叉處下方做1個“V”形切口，輕輕插入前段包被多聚賴氨酸的尼龍線栓；當栓線插入距頸總動脈分叉1.8 ～ 2.0 cm處并有阻力感時，說明一起結(jié)扎栓在中動脈起始部位阻塞動脈，即停止插栓線，將線栓與頸總動脈一起結(jié)扎并固定，縫合皮膚。在阻斷血流90 min后輕輕拔出栓線，此時開始計算再灌注時間，于24、48和72 h后觀察各項指標。假手術(shù)組大鼠只分離血管，不結(jié)扎動脈，不插入線栓。

1.4 各組大鼠行為學評分的檢測 觀察大鼠肢體癱瘓、站立、肢體屈曲和行走情況。采用Ji[6]的5級4分法進行神經(jīng)功能評分：無明顯神經(jīng)功能缺損記為0分；左前肢伸展障礙記為1分；行走時向左側(cè)旋轉(zhuǎn)打圈記為2分；行走時向左側(cè)傾倒記為3分；不能自發(fā)行走，意識喪失，昏迷記為 4分；動物死亡記為 5分。評分為0、4和5分的大鼠均被剔除，剔除的大鼠在后續(xù)實驗中得到補充。

1.5 TTC 染色 大鼠腦缺血90 min后分別再灌注24、48和72 h時采用10% 水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉大鼠后斷頭取腦，切除嗅球、小腦及部分低位腦干后，將剩余腦組織放入-20℃ 冰箱速凍20 min，每隔2 mm切1片,然后置于盛有2% TTC溶液的緩沖液中，37℃ 避光恒溫孵育15 min, 期間翻動腦片使染色均勻避免粘連。待腦組織染色后將其轉(zhuǎn)移至10% 甲醛溶液中固定30 min，采用數(shù)碼相機對染色后的腦組織切片照相。

1.6 大鼠腦缺血梗死體積的計算 將數(shù)碼相機拍攝的圖片輸入計算機，采用Image J軟件測量大鼠每個腦片的缺血區(qū)域體積、缺血側(cè)半球體積和缺血對側(cè)半球體積。為了減少腦水腫對腦梗死體積計算的影響，采用矯正后腦梗死體積計算公式：腦梗死體積=[缺血區(qū)域體積-(缺血側(cè)半球體積-缺血對側(cè)半球體積)]/缺血對側(cè)半球體積×100%。

1.7 大鼠腦組織 RNA 的提取和質(zhì)量檢測 大鼠腦缺血/再灌注24、48和72 h后以10% 水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉后置于冰上快速斷頭取出腦組織，剝離大腦皮層后取大腦皮層梗死中心區(qū)域、缺血半暗帶區(qū)域及缺血對側(cè)皮層區(qū)域組織稱質(zhì)量。假手術(shù)組大鼠均取出相應皮層區(qū)域。將100 mg組織樣本加入1 mL Trizol試劑，快速勻漿，依據(jù)Trizol試劑說明書提取總RNA。采用美國Thermo公司生產(chǎn)的NanoDrop○RND-1000紫外分光光度儀檢測波長260和280 nm處吸光度(A)值，計算RNA濃度和純度，A(260)/A(280)比值為1.8 ～ 2.1時表示RNA純度較純，采用變性瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性。

1.8 qRT-PCR法檢測大鼠腦組織中miR-155表達水平 將上述質(zhì)量檢測良好的總RNA樣本采用TaqMan○RMicroRNA Reverse Transcription Kit逆轉(zhuǎn)出miR-155和U6 snRNA(做內(nèi)參)的cDNA。采用TaqMan○RMicroRNA Assays和TaqMan○RUniversal PCR Master Mix Ⅱ with UNG試劑盒按照說明書進行qRT-PCR,所有反應均設(shè)立3個復孔。記錄每個反應管中標本的CT值。本研究結(jié)果采用qRT-PCR中的相對定量法進行分析，采用2-△△CT法表示大鼠腦缺血/再灌注組織中miR-155表達水平相對于假手術(shù)組表達水平的變化倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦缺血/再灌注模型的建立 腦缺血/再灌注模型建立24 h后根據(jù)Ji等[6]的5級4分法評估大鼠神經(jīng)缺損程度，評分為2 ～ 3分的大鼠進行入組觀察，評分為2分的大鼠見圖1(插頁一)。大鼠全腦切片TTC染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腦組織TTC染色表現(xiàn)為均勻一致的紅色，腦缺血/再灌注組大鼠腦缺血側(cè)腦組織TTC 染色后出現(xiàn)大范圍未染色區(qū)域，見圖2(插頁一)，表明大鼠腦缺血/再灌注模型建立成功。

2.2 2組大鼠腦缺血梗死體積 腦缺血/再灌注后24、48和72 h，TTC染色可見腦缺血/再灌注組大鼠右側(cè)大腦的缺血灶，并且在腦缺血/再灌注24 h時大鼠腦缺血梗死體積最大，在48 h時大鼠腦缺血梗死體積開始減少，腦缺血/再灌注72 h時腦缺血梗死體積繼續(xù)縮小。與假手術(shù)組比較，再灌24、48和72 h時腦缺血/再灌注組大鼠腦缺血梗死體積明顯增大(P<0.05)。見圖3。

*P<0.05vssham operation group;△P<0.05vsI/R group (24 h);#P<0.05vsI/R group (48 h).

圖3 各組大鼠腦梗死體積直條圖

Fig.3 Histogram of cerebral infarction volumes of rats in various groups

2.3 各組大鼠腦組織中總RNA 濃度和純度 采用紫外吸收測定法測定大鼠腦組織樣品總RNA 濃度和純度，總RNA濃度為150 ～ 700 g·L-1，A(260)/A(280)比值均為1.8～2.1。見表1。瓊脂糖凝膠電泳可見清晰的28 S核糖體和18 S核糖體條帶，同時還可以觀察到1條更小的稍微擴散的條帶，其由低相對分子質(zhì)量的RNA (tRNA 和 5 S核糖體RNA)組成。見圖4。

2.4 腦缺血/再灌注腦皮層組織和正常腦皮層組織中miR-155表達水平 與假手術(shù)組比較，腦缺血/再灌注組大鼠大腦皮層梗死中心區(qū)域及缺血半暗帶區(qū)域miR-155表達水平明顯升高(P<0.05)，在缺血半暗帶區(qū)域內(nèi)miR-155表達水平在24 h最高，之后逐漸降低，72 h 仍未降至正常水平，而在梗死中心區(qū)域24和48 h均持續(xù)在最高狀態(tài)，之后開始降低。見圖5。

表1 各組大鼠腦組織中總 RNA 濃度和純度

A:Sham operation goup;B:I/R group；M:Marker;Lane 1:Ischemic core;Lane 2:Peri-infarction area;Lane 3:Contralateral area.

圖4 各組大鼠腦組織總RNA 表達電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of total RNA in brain tissue of rats in various groups

*P<0.05 vs sham operation group at the same time point.

Fig.5 Expression levels of miR-155 in cortex tissue of rats in various groups

3 討 論

缺血性腦損傷是一類由于血栓或者栓子阻斷了腦血管的血流從而導致相應供血區(qū)腦組織缺血缺氧造成局灶性腦組織損傷的中樞神經(jīng)疾病。目前缺血半暗帶是缺血性腦損傷功能恢復治療的主要靶區(qū)[7-8]。缺血半暗帶是梗死中心區(qū)周圍環(huán)形區(qū)域，該區(qū)域的細胞雖然神經(jīng)功能喪失但其結(jié)構(gòu)仍保留完整性[9]。缺血半暗帶可以通過側(cè)支循環(huán)的建立恢復血液供應從而恢復其功能，但同時會造成再灌注損傷，導致神經(jīng)元不可逆性死亡。腦缺血/再灌注損傷機制十分復雜，過量氧自由基的生成及炎癥反應是其重要原因[10-11]。研究[12]表明miR-155 在大鼠心肌缺血/再灌注損傷組織中表達水平明顯升高，并且可以通過調(diào)節(jié)炎癥細胞聚集及活性氧爆發(fā)從而加重心肌細胞的缺血/再灌注損傷。因此，探討miR-155 在腦缺血/再灌注損傷中的表達變化十分必要。

本研究采用qRT-PCR法檢測大鼠腦組織中miR-155表達水平，結(jié)果顯示：腦缺血/再灌注組大鼠梗死中心區(qū)及半暗帶區(qū)域的腦皮層組織中miR-155 表達水平表達明顯高于假手術(shù)組，且在半暗帶區(qū)域中miR-155表達水平在24 h最高，之后逐漸降低，72 h 仍未降至正常水平；而在梗死中心區(qū)域中miR-155表達水平在24 ～ 48 h時維持在最高值，之后開始降低，miR-155表達水平與再灌注時間有關(guān)聯(lián)，隨著再灌注時間的延長，miR-155表達水平逐漸降低，提示在腦缺血/再灌注損傷早期腦皮層組織中miR-155表達水平升高，說明miR-155參與了缺血/再灌注損傷過程，并可能起到促進腦缺血/再灌注損傷的作用。這一結(jié)果與既往研究[5,12-13]一致。Hunsberger 等[5]在腦缺血后24 h大鼠腦皮質(zhì)組織中檢測了 miRNA 表達譜，其中 miR-155表達水平存在差異，采用qRT-PCR 技術(shù)驗證結(jié)果顯示：腦缺血后24 h大鼠腦皮質(zhì)組織中 miR-155表達水平明顯升高。但Hunsberger等[5]只檢測了缺血后24 h時miR-155表達水平，并未進一步觀察其在腦缺血/再灌注后一段時間內(nèi)的動態(tài)變化。研究[12]顯示：miR-155 在大鼠心肌缺血/再灌注組織中表達水平明顯升高，并且加重心肌缺血/再灌注損傷，因而認為心肌缺血/再灌注可以誘導 miR-155 表達。Wan等[13]研究顯示：細胞在低氧狀態(tài)下可誘導miR-155表達水平升高，并在48 h 內(nèi)逐漸升高。但少數(shù)研究[14]顯示：在缺血性腦損傷后miR-155 表達水平降低。Liu等[14]使用TaqMan rodent miRNA arrays檢測腦缺血后腦損傷miRNA 表達譜發(fā)現(xiàn)miR-155表達水平明顯降低。

有關(guān)miR-155 對缺血/再灌注損傷的作用及其病理機制目前報道甚少。研究[12]顯示：miR-155通過介導炎癥細胞聚集及活性氧爆發(fā)加重心肌缺血/再灌注損傷。miR-155 已被證實參與各種病理炎癥反應過程[15-17]。miR-155 可以促進組織炎癥反應，下調(diào)miR-155 可以減輕炎癥反應[18-20]。特異性抑制miR-155 可增加內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS) 表達和一氧化氮 (nitric oxide，NO) 產(chǎn)生從而減少血管炎癥反應[21-23]。研究[24-25]顯示：小鼠腦缺血后抑制 miR-155 可以改變主要細胞因子及炎癥反應相關(guān)分子的表達時間，從而影響炎癥反應進展和組織修復，因此推斷miR-155可能加重腦缺血/再灌注損傷，并可能通過介導炎癥反應參與腦缺血/再灌注損傷過程。關(guān)于miR-155是否加重腦缺血/再灌注損傷以及是否通過調(diào)節(jié)炎癥反應加重缺血/再灌注損傷有待進一步研究。