張曉田，金 李，李慧賢，楊世峰，牛 丹，路萬虹

腎臟損害是慢性乙肝病毒(HBV)感染最常見的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗原(HBcAg)在腎小球、腎小管及腎小動脈血管壁沉積，同時伴隨腎臟炎癥、系膜增生及腎功能損害等病理征象[1]。我國慢性HBV感染人群約有1億人，HBV感染及其并發(fā)癥的防治對提高國民生活和醫(yī)療水平至關(guān)重要，是一個亟待解決的現(xiàn)實問題[2]。目前HBV感染腎損害的病理機制尚未完全明確，細胞自噬是真核細胞利用溶酶體降解受損細胞器和大分子蛋白質(zhì)，并將其重新納入能量循環(huán)的過程。在感染性或炎性疾病中，細胞自噬是一把雙刃劍，適度的自噬對于維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要，過度自噬則可能引起更嚴(yán)重的細胞死亡和組織損傷[3-4]。本研究設(shè)計體外干預(yù)實驗，觀察HBV感染過程中Toll樣受體4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信號通路與腎小管上皮細胞自噬的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 人腎小管上皮細胞系HK-2，購自上海名勁生物科技有限公司。

1.2實驗試劑 TLR4激動劑LPS-PG(上?？道噬锟萍加邢薰荆瑃lrl-ppglps)，TLR4抑制劑TAK-242(杭州聯(lián)科生物，2A-13871-5)；RPMI 1640 培養(yǎng)基(上海浩然生物技術(shù)有限公司，12633-012)；胎牛血清(上海浩然生物技術(shù)有限公司，16000044)；DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，DA1010)；CCK-8試劑盒(北京碧云天，C0038)；細胞核蛋白與漿蛋白抽泣試劑盒(北京碧云天，P0027)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天，P0010S)；TLR4、NF-κB、p62、LC-3B、Beclin-1 及β-actin抗體均購自Abcam官網(wǎng)。

1.3實驗儀器 無菌操作臺(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司，JB-CJ-1000FX )，細胞培養(yǎng)箱(上海躍進，WJ-3-160q)，低溫高速離心機(德國Eppendorf，Eppendorf 5427 R)，倒置顯微鏡(德國Olympus，CKX53 )，恒溫振蕩器(上海啟步生物科技有限公司，BSW-211C)，垂直電泳及電轉(zhuǎn)印裝置及其配套耗材(均為美國伯樂原裝，型號Mini-PROTEAN Tetra)，電動勻漿器(美國Kimble，749521-1500)。

1.4細胞培養(yǎng)和干預(yù)方法 將人腎小管上皮細胞系HK-2細胞接種于培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)和傳代，采用RPMI 1640 培養(yǎng)基+10%的胎牛血清，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，當(dāng)細胞生長至融合至80%左右進行傳代。取2代細胞接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)置空白組、HBV感染組、TLR4激動劑組和TLR4抑制劑組。空白組僅培養(yǎng)2代HK-2細胞；HBV感染組加入HBV感染的人血清，所用血清均分離于本科室接收的慢性HBV感染患者；TLR4激動劑組同時加入HBV感染的人血清和10 ng/ml的LPS-PG；TLR4抑制劑組同時加入HBV感染的人血清和10 ng/ml的TAK-242。37℃，5%CO2，培養(yǎng)7 d，繪制細胞生長曲線，并采用CCK-8試劑盒測定HBV感染組、TLR4激動劑組和TLR4抑制劑組的細胞毒性活力。

1.5TLR4信號通路測定方法 細胞培養(yǎng)7 d后進行爬片，采用24孔板和配套的細胞爬片專用玻片進行操作，使用前玻片泡酸過夜，清洗，高壓消毒和烤干。胰酶消化細胞重懸于1640培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度為1×105；24孔板中先放入蓋玻片，再接種細胞，培養(yǎng)48 h，丙酮固定并取出；取出后的蓋玻片可直接蓋于載玻片上，50%甘油封片后即可進行免疫組化實驗。滴加0.3%的過氧化氫(H2O2)孵育30 min，清除內(nèi)源性H2O2酶活性，PBS清洗5 min×3次，0.5%的Triton X-100孵育20 min，以增加細胞通透性，起到破膜和暴露抗原的目的。一抗孵育，4℃過夜，TLR4與NF-κB的抗體濃度均為1∶500，PBS清洗5 min×3次；二抗孵育，37℃孵育40 min。DAB試劑盒顯色，梯度乙醇脫水之后，封片鏡檢。并采用圖像分析軟件ImagePro Plus 分析陽性表達強度。

1.6細胞自噬測定方法 細胞培養(yǎng)7 d后，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗細胞，并采用蛋白質(zhì)抽提試劑盒提取總蛋白，進行免疫蛋白印跡(WB)實驗。組裝電泳槽，配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠和電泳緩沖液，以每個電泳通道10 μg的蛋白量進行電泳，先以60 V電泳30 min以清除凝膠內(nèi)雜質(zhì)，再調(diào)至90 V電泳1 h，此時蛋白按照分子量大小依次分割為不同的條帶。組裝電轉(zhuǎn)印裝置，配置轉(zhuǎn)印緩沖液，以80 V電轉(zhuǎn)印30 min，麗春紅染液觀察轉(zhuǎn)印效果。條帶筆直清晰者進行封閉與抗體孵育，封閉液和抗體稀釋液均以脫脂牛奶配置，封閉液濃度為5%，抗體稀釋液為3%，β-actin、Beclin-1、p62和LC-3B的一抗?jié)舛染鶠?∶2000，4℃孵育過夜；二抗的濃度分別為1∶2000、1∶1500、1∶2000和1∶1800，37℃孵育90 min。抗體孵育完畢，PBST液清洗，ECL熒光顯色，暗室顯影，拍照，采用圖像分析軟件Image J分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1細胞生長曲線與毒力活性 各組細胞生長曲線大致呈雙S型，符合細胞生長一般規(guī)律。對照組生長速率最快，HBV感染組明顯變慢，TLR4激動劑組最慢，TLR4抑制劑組位于HBV感染組和對照組之間。經(jīng)CCK-8實驗測得，TLR4激動劑組細胞毒性活力高于HBV感染組和TLR4抑制劑組，且HBV感染組高于TLR4抑制劑組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組腎小管上皮細胞的生長曲線

2.2TLR4信號通路表達水平 HBV感染組、TLR4激動劑組和TLR4抑制劑組TLR4與NF-κB表達水平均高于對照組(P<0.05)。TLR4激動劑組TLR4與NF-κB表達水平高于HBV感染組，TLR4抑制劑組低于HBV感染組(P<0.05)。見表1。

表1 各組腎小管上皮細胞TLR4信號通路表達水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與HBV感染組比較，cP<0.05；與TLR4激動劑組比較，eP<0.05

2.3細胞自噬表達水平 HBV感染組、TLR4激動劑組、TLR4抑制劑組Beclin-1和LC-3B表達水平均高于對照組，P62表達水平均低于對照組(P<0.05)。與HBV感染組比較，TLR4激動劑組Beclin-1 和LC-3B表達水平升高，P62表達水平降低(P<0.05)；TLR4抑制劑組Beclin-1和LC-3B表達水平均降低，P62表達水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組腎小管上皮細胞TLR4信號通路表達水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與HBV感染組比較，cP<0.05；與TLR4激動劑組比較，eP<0.05

3 討論

腎損傷是HBV感染的最常見并發(fā)癥之一，近幾年來，細胞自噬是其病理機制的研究熱點[5-6]。細胞自噬是指細胞通過溶酶體系統(tǒng)降解受損細胞器和長半衰期蛋白的過程，能被饑餓、創(chuàng)傷應(yīng)激、病原菌入侵等激活，其目的在于及時清理細胞內(nèi)雜質(zhì)，并分解供能，以在惡性環(huán)境中維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。TLRs是機體內(nèi)的非特異性免疫分子，能快速識別突破機體物理屏障的病原微生物；TLRs還是非特異性免疫和獲得性免疫的橋梁，在識別病原微生物后，能夠通過免疫介質(zhì)及其信號通路激活細胞免疫[7-8]。TLR4是目前已發(fā)現(xiàn)最特殊的TLRs，可識別革蘭氏陽性菌脂多糖及病毒的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，因此TLR4及其相關(guān)信號通路對細菌與病毒均有免疫調(diào)控活性[9]。在心腦血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究中，楊會如等[10]證實啟動TLR4/NF-κB通路能夠激活自噬信號，對抗缺血缺氧性損傷。HBV感染致腎損傷中也有自噬信號異常激活，但是否與TLR4/NF-κB通路有關(guān)尚不明確。

本研究采用HBV感染患者的血清感染人腎小管上皮細胞系HK-2細胞，并進行體外培養(yǎng)和TLR4靶向干預(yù)實驗，以分析TLR4/NF-κB通路對自噬是否有調(diào)控作用。從細胞生長曲線來看，HBV感染后HK-2細胞的生長速率明顯減慢，這主要是因為病毒感染引起了細胞死亡。文獻報道[11]，在HBV感染后，肝臟病理組織同時存在凋亡小體和自噬小體，兩者共同參與了HBV感染的病理進程。本研究結(jié)果顯示，TLR4激動劑組細胞生長速率進一步減慢，TLR4抑制劑組的細胞生長速率有所升高，說明抑制TLR4信號對于緩解HBV感染引發(fā)的細胞死亡有緩解作用。在所有TLR4相關(guān)信號中，TLR4/NF-κB通路是橋接病原微生物免疫、炎性損傷及局部組織壞死的關(guān)鍵通路[12]，因此本研究選擇這兩個關(guān)鍵介質(zhì)展開分析，結(jié)果證實HBV感染后TLR4/NF-κB信號通路被激活，TLR4和NF-κB表達水平同時上調(diào)。

本研究對各組細胞的Beclin-1、LC-3B和P62表達均做了測定，三者在自噬生理病理中具有不同的意義：Beclin-1是細胞自噬的“守門人”，主要介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位于吞噬泡的過程，以此調(diào)節(jié)自噬體膜合成和物質(zhì)轉(zhuǎn)運，是自噬小體形成與成熟的必需物質(zhì)[13-14]。LC-3B具有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，靜息狀態(tài)下以前者為主要存在形式，定位于胞質(zhì)，當(dāng)自噬流被激活后，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ并移位于胞膜，同時由于LC3-Ⅱ的分子量較LC3-Ⅰ有所降低，WB實驗可同時看到LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩條條帶，因此多數(shù)研究以WB實驗測定LC-3B的表達水平，并以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ作為衡量自噬強度的重要指標(biāo)[15-16]。真核細胞主要存在兩種蛋白降解系統(tǒng)，泛素蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體系統(tǒng)，p62是SQSTM1基因編碼的泛素結(jié)合蛋白，也稱為SQSTM1蛋白，在細胞自噬和細胞凋亡中均介導(dǎo)重要機制。文獻報道[17]，無論自噬上游還是下游信號被阻斷，都會導(dǎo)致P62聚集，P62表達與自噬強度呈負相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)HBV感染組的Beclin-1 和LC-3B表達水平升高，P62表達水平降低，說明HBV感染激活了腎小管上皮細胞的自噬，這可能是一種自我保護機制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，激活TLR4/NF-κB信號通路后自噬水平加強，而抑制TLR4/NF-κB信號通路后自噬水平有所減弱，證實通過靶向干預(yù)TLR4能夠調(diào)控HBV感染腎小管上皮細胞的自噬。

綜上所述，本研究證實TLR4信號通路在腎小管上皮細胞HBV感染過程中可能參與了細胞自噬的調(diào)節(jié)作用，可能是其病理機制的重要組成部分，具有深入研究的價值。