任省濤,郭夏麗,蘆阿虔,張倩倩,郭笑盈,王 巖*,王連忠,張寶寶

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林可霉素菌渣堆肥抗生素抗性基因變化分析

任省濤1,郭夏麗1,蘆阿虔1,張倩倩1,郭笑盈1,王 巖1*,王連忠2,張寶寶2

(1.鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院,河南 鄭州 450001；2.河南省新鄉(xiāng)華星制藥廠,河南 新鄉(xiāng) 453731)

為了研究抗生素菌渣堆肥過(guò)程中抗生素抗性基因(ARGs)的變化情況,以林可霉素菌渣-糠醛渣堆肥為研究對(duì)象,以污泥-糠醛渣堆肥為對(duì)照.運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)到了堆肥過(guò)程中-01、1、、、等5種林可霉素抗性基因和整合子基因1的變化情況.結(jié)果表明,堆肥化處理可以降解99%的林可霉素殘留,兩者堆肥ARGs總量絕對(duì)豐度均有較大增加,而相對(duì)豐度降低5%~22%.同時(shí)發(fā)現(xiàn)林可霉素菌渣堆肥有助于1的富集,表明林可霉素菌渣堆肥存在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn).冗余分析顯示, ARGs變化受環(huán)境因子影響嚴(yán)重,影響順序?yàn)閜H值>林可霉素殘留>溫度>C/N.

堆肥；抗生素；林可霉素菌渣；熒光定量PCR；ARGs

隨著抗生素藥物的長(zhǎng)期濫用,大量耐藥性細(xì)菌,甚至超級(jí)細(xì)菌事件層出不窮.抗生素及導(dǎo)致的抗生素抗性基因(ARGs)問(wèn)題越來(lái)越引起關(guān)注[1-3].耐藥菌甚至超級(jí)細(xì)菌的背后其實(shí)是ARGs的快速蔓延和急劇傳播.河流、土壤、畜禽糞便、凍土、蔬菜、奶制品、肉制品等均檢測(cè)到不同種類不同豐度的ARGs存在,ARGs污染正在越來(lái)越多的影響人類健康[5-13].

中國(guó)已經(jīng)成為全球抗生素第一大生產(chǎn)國(guó),據(jù)統(tǒng)計(jì)2013年中國(guó)抗生素總產(chǎn)量高達(dá)24.8萬(wàn)t,約占世界的2/3[14].抗生素生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的抗生素菌渣,每年的產(chǎn)量更是高達(dá)200多萬(wàn)t[15].抗生素菌渣因含有高含量的抗生素殘留,對(duì)環(huán)境污染產(chǎn)生巨大的潛在風(fēng)險(xiǎn),不合理的處置方式極有可能引起抗生素或抗性基因污染[16-18].

堆肥法由于其能夠高效轉(zhuǎn)化有機(jī)污染廢物,已被用于越來(lái)越多的固體廢棄物處理.研究表明堆肥法能夠降解畜禽糞便、抗生素菌渣等固體廢棄物中的抗生素,使抗生素殘留降解到極低水平[19-22].并且,已有研究表明堆肥法處理畜禽糞便可以大幅消減ARGs的傳播和擴(kuò)散[23-24].但是抗生素菌渣堆肥過(guò)程中ARGs的變化情況以及ARGs與環(huán)境因子的關(guān)系研究較少[25-26].本文采用分子生物學(xué)方法,運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù),分析堆肥過(guò)程中ARGs的變化情況.同時(shí),分析環(huán)境因子與ARGs的相互關(guān)系,以期為林可霉素菌渣堆肥化的環(huán)境安全性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 堆肥材料

林可霉素菌渣取自河南省新鄉(xiāng)華星制藥廠;糠醛渣取自河南省新鄉(xiāng)縣糠醛廠;草木灰取自河南省新鄉(xiāng)縣秸稈電廠.污泥取自河南省新鄉(xiāng)劉莊生活污泥.供試材料的理化性質(zhì)如表1所示.

表1 堆肥材料理化性狀

1.2 試驗(yàn)處理

根據(jù)物料配比不同,設(shè)計(jì)2個(gè)處理.控制各堆體質(zhì)量約900kg,初始含水率在60%左右.通過(guò)試驗(yàn)測(cè)得草木灰的添加量為糠醛渣的20%時(shí),糠醛渣的pH值即可調(diào)節(jié)到6.0左右.試驗(yàn)處理如表2所示.

表2 堆肥實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

堆肥過(guò)程中采取人工鐵鍬翻堆方式,3d翻堆一次.每3d取樣一次,測(cè)定水分,保持水分不低于50%,若低于50%后,加水保持水分55%~60%.

1.3 樣品采集

堆肥過(guò)程中每3d人工翻堆混勻一次,混合均勻后從堆體的前、后、左、右和中心5個(gè)點(diǎn)取樣,混勻?yàn)橐粋€(gè)樣品.分兩部分分別保存于?20℃和4℃. ?20℃樣品進(jìn)行抗生素殘留測(cè)定同時(shí)送上海生工股份有限公司進(jìn)行抗性基因的測(cè)定;4℃樣品進(jìn)行pH值、水分、有機(jī)質(zhì)、全氮等的測(cè)定.初始樣、升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期樣品分別取自堆體的第0、13、34、55和66d,處理樣命名分別為:T0、T13、T34、T55、T66;對(duì)照樣分別命名為CK0、CK13、CK34、CK55、CK66.

1.4 抗生素殘留測(cè)定

取相當(dāng)于堆肥干重10g的堆肥鮮樣,超純水50mL,渦輪振蕩5min.超聲萃取60min,過(guò)濾,以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心30min,取上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜后于HPLC上測(cè)定.色譜柱條件為:儀器型號(hào)為Agilent1200LC,儀器生產(chǎn)廠家為Supelco,色譜柱為Discovery C18柱,柱溫30℃,檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm,流動(dòng)相為0.05mol/L硼砂溶液(85%磷酸調(diào)節(jié)pH=6):甲醇=50:50;流速為1mL/min,樣品進(jìn)樣量為20μL.

1.5 堆肥樣品DNA的提取

堆肥樣品 DNA 按照 FastDNA SPIN Kit for Soil 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,用核酸蛋白質(zhì)分析儀NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington. DE)測(cè)定DNA濃度,–20℃保存.

1.6 林可霉素抗性基因及細(xì)菌數(shù)量的熒光定量PCR

本文中所用的、1和16引物序列[27-28]及熒光定量PCR均由上海生工股份有限公司完成.所有引物先進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增,凝膠電泳.檢測(cè)存在后再進(jìn)行熒光定量PCR.15種抗性基因、1種整合子基因和16S rDNA引物序列經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR后,凝膠電泳發(fā)現(xiàn)只檢測(cè)到-01、1、、、和1、16S rDNA的條帶.所以這些基因進(jìn)行后續(xù)熒光定量PCR.PCR具體參數(shù)見(jiàn)表3.

實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)2值為0.9993~ 1.0000,擴(kuò)增效率范圍為96.0%~108.2%.林可霉素抗性基因采用Taqman水解探針?lè)ㄖ谱鱭PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線.反應(yīng)為25mL體系,包括Taq Buffer 2.5mL,上下游引物各0.5mL,探針0.5mL,dNTP(10mmol/L)0.5μL, MgCl2(25mmol/L) 2μL,Taq酶(5U/μL)0.2μL,超純水18.3μL.同時(shí)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因用SYBR染料法定量.

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行處理,采用Origin9.0進(jìn)行作圖,用SPSS 進(jìn)行相關(guān)性分析,用canoco 5.0進(jìn)行冗余分析.抗性基因相對(duì)豐度=抗性基因拷貝數(shù)/基因拷貝數(shù)

表3 目的基因引物序列,退火溫度及序列長(zhǎng)度

2 結(jié)果分析

2.1 林可霉素菌渣堆肥過(guò)程中溫度變化

圖1 堆肥過(guò)程中溫度變化

由圖1可以看出,林可霉素菌渣堆肥第5d即達(dá)到50℃以上高溫,最高溫度為第48d時(shí)的58℃,高溫保持時(shí)間高達(dá)51d.而污泥堆肥第3d即進(jìn)入高溫期,最高溫度為第17d的62℃,高溫保持時(shí)間為45d.林可霉素菌渣堆肥最高溫度和高溫期均滯后于污泥堆肥.Ezzariai等[29]研究表明高濃度抗生素存在下,堆體高溫期和最高溫度出現(xiàn)時(shí)間嚴(yán)重滯后,與本文類似.

2.2 林可霉素菌渣堆肥中林可霉素殘留變化

圖2 堆肥過(guò)程中林可霉素殘留的變化

如圖2所示,林可霉素殘留降解趨勢(shì)先是緩慢降解,待堆肥進(jìn)入高溫期后,降解速度加快.特別是堆肥前20d,降解率高達(dá)80%.表明堆肥化處理可以降低抗生素殘留,最終林可霉素殘留從最初的3180mg/kg降解到65mg/kg,降解率高達(dá)99%.堆肥化處理有助于大幅降解抗生素殘留,實(shí)現(xiàn)抗生素殘留的無(wú)害化.

2.3 抗性基因變化趨勢(shì)

為了消除DNA提取率和細(xì)菌數(shù)量的影響,用相對(duì)豐度來(lái)反映抗性細(xì)菌在整個(gè)細(xì)菌總量中的比例顯得更為準(zhǔn)確.如圖3所示,5種抗性基因和整合子基因變化情況大致分為3類.

圖3 堆肥過(guò)程中抗性基因和整合子相對(duì)豐度的變化情況

2.3.1-01和基因的變化情況-01和隨著堆肥進(jìn)程呈現(xiàn)急劇下降趨勢(shì),堆肥34d后去除率均高達(dá)99%.分析原因可能是堆肥初始期2種抗性基因的宿主菌不耐高溫,待堆肥進(jìn)入高溫期后,兩者抗性基因的宿主急劇減少所致.同時(shí)發(fā)現(xiàn)-01基因與林可霉素殘留呈現(xiàn)極顯著正相關(guān),表明-01基因的宿主菌可能是林可霉素降解菌.

2.3.21作為整合子基因,能夠攜帶抗性基因進(jìn)行物種間傳播,有基因漂流風(fēng)險(xiǎn)1和1這兩個(gè)基因在林可霉素菌渣堆肥和污泥堆肥過(guò)程中呈現(xiàn)相反趨勢(shì).其中兩者在林可霉素菌渣堆肥中急劇增加,特別是在高溫期達(dá)到峰值,分別為初期的6.3和10倍.堆肥結(jié)束后兩者分別增加了5.1和7.3倍.而兩者在污泥整個(gè)堆肥過(guò)程中變化不大,堆肥結(jié)束后1增長(zhǎng)12%,1增長(zhǎng)24%.表明林可霉素菌渣堆肥有利于富集1轉(zhuǎn)座基因和1抗性基因,對(duì)環(huán)境生態(tài)存在一定風(fēng)險(xiǎn).任省濤等[30]研究林可霉素菌渣與豬糞混合堆肥,結(jié)果表明林可霉素菌渣堆肥高溫期主要是不同屬類的芽孢桿菌,推測(cè)這些芽孢桿菌屬可能是1和1的主要宿主菌.

2.3.3和抗性基因兩者在林可霉素菌渣和污泥堆肥過(guò)程中均呈現(xiàn)相同趨勢(shì),首先隨著堆肥進(jìn)入高溫期兩者呈現(xiàn)急劇下降趨勢(shì),高溫期一直維持較低含量,腐熟期后又有所上升.表明兩者的宿主細(xì)菌可能均不耐高溫.堆肥結(jié)束后在林可菌渣堆肥中減少51%,而在污泥堆肥中卻增加了59%.在兩者堆肥中分別減少40%和79%.堆肥結(jié)束后林可霉素菌渣堆肥中和相對(duì)豐度雖有一定程度的降低,但是總量依然高于污泥堆肥.

2.4 16S rDNA、AGRs、intI1和林可霉素相關(guān)性分析

表4 16S rDNA、AGRs、intI1和林可霉素相關(guān)性分析

注:*.在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān),**.0.1水平上的相關(guān)性.

通過(guò)SPSS進(jìn)行相關(guān)性分析如表3所示,結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了-01外,其余均與細(xì)菌16S呈顯著相關(guān)性.表明堆肥過(guò)程抗性基因的增多或減少主要是與細(xì)菌數(shù)量的多少顯著相關(guān).同時(shí)發(fā)現(xiàn)1與1和呈現(xiàn)強(qiáng)相關(guān)性,表明1和抗性基因可能與整合子基因在同一質(zhì)?；蛲蝗旧w上,Qian等[31]研究3種不同濃度的土霉素添加量對(duì)畜禽糞便堆肥中抗性基因的變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),土霉素的添加有助于富集某些抗性基因與本文結(jié)論相同.

2.5 ARGs絕對(duì)和相對(duì)總量變化趨勢(shì)

2.5.1 ARGs絕對(duì)總量變化趨勢(shì) 由圖4可知,無(wú)論林可霉素菌渣堆肥還是污泥堆肥,兩者抗性基因總量隨著堆肥進(jìn)程均有極大的增加,表明堆肥有助于抗性基因的富集.其中林可霉素菌渣堆肥初始時(shí)主要以-01、和為主,隨著堆肥進(jìn)行,-01和急劇下降,1和1急劇上升.在高溫期34d總抗性基因量達(dá)到最大峰值,為初始樣本的750倍,堆肥進(jìn)入腐熟期后有所降低,堆肥結(jié)束時(shí)抗性基因總量為初始樣的179倍,其中1、1和占據(jù)了總抗性基因的98%.而污泥堆肥開始時(shí)以1、1、和為主,堆肥結(jié)束時(shí),兩種堆肥方式主要抗性基因趨同主要以1、1和為主,占據(jù)95%.抗性基因總量增長(zhǎng)75倍.相關(guān)性分析(表3)表明,堆肥抗性基因與轉(zhuǎn)座子均與細(xì)菌數(shù)量呈顯著正相關(guān),表明堆肥抗性基因的增加主要是由于堆肥細(xì)菌數(shù)量增加所致.1抗性基因在不同物種轉(zhuǎn)移方面具有潛在風(fēng)險(xiǎn).二者堆肥結(jié)束后1較初始分別增加971倍和108倍,表明堆肥有助于1的富集,堆肥化處理方式存在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn).

2.5.2 ARGs相對(duì)總量變化趨勢(shì) 相對(duì)豐度可以較好的排除樣本DNA提取率和細(xì)菌數(shù)量的影響,代表了細(xì)菌群落中含有抗性基因細(xì)菌的比例.從一定意義上來(lái)說(shuō),作為環(huán)境生態(tài)評(píng)價(jià)更有意義.由圖5可以看出,林可霉素菌渣堆肥初始樣總抗性基因豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于污泥堆肥,可能是因?yàn)榱挚擅顾貧埩舢a(chǎn)生的選擇性壓力,導(dǎo)致抗性基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于污泥堆肥.特別是高溫時(shí)林可霉素菌渣堆肥抗性基因豐度急劇升高,堆肥34d達(dá)到最大值, 為初始總抗性基因豐度的1.2倍.其中整合子基因1相對(duì)豐度在堆肥34d也達(dá)到了峰值,為初始樣的6倍,表明堆肥高溫期整合子基因l1發(fā)生了強(qiáng)烈的基因轉(zhuǎn)移作用.堆肥結(jié)束后,林可霉素菌渣堆肥中1增加了5倍,而污泥堆肥中1只增加了13%,表明林可霉素菌渣堆肥有助于富集1,存在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn).堆肥結(jié)束后二者抗性基因相對(duì)豐度較初始分別降低了5%~22%.從這一角度講堆肥化處理有利于抗性基因的消減.

圖4 堆肥過(guò)程中抗性基因絕對(duì)豐度的變化情況

圖5 堆肥過(guò)程中抗性基因相對(duì)豐度變化情況

2.6 ARGs與環(huán)境的相互關(guān)系

圖6可以看出, ARGs與環(huán)境因子做冗余分析, RDA兩軸可解釋度達(dá)到84.5%,表明環(huán)境因子對(duì)抗性基因具有很大影響.其中pH值、C/N、林可霉素殘留、溫度均對(duì)ARGs變化產(chǎn)生巨大影響.影響程度順序依次為pH值>林可霉素殘留>溫度>C/N.同時(shí)也發(fā)現(xiàn)堆肥不同階段環(huán)境因子影響因素也不同.堆肥初期到升溫期,林可霉素殘留對(duì)堆肥抗性基因-01影響顯著.隨著堆肥進(jìn)入高溫期和腐熟期, pH值和溫度開始發(fā)揮作用.尤其對(duì)1、1、、、產(chǎn)生顯著影響.有研究表明高溫或pH值的急劇變化有可能導(dǎo)致某些細(xì)菌發(fā)生SOS應(yīng)答,從而有利于富集某些ARGs以抵御不利環(huán)境[32-34].從圖6也可以看出兩者堆肥ARGs在堆肥初期和升溫期受林可霉素殘留的影響,兩者ARGs差異較大,隨著堆肥進(jìn)行,差異逐漸減小.主要是因?yàn)榱挚擅顾貧埩舻挠绊?隨著林可霉素殘留大幅降解,兩者堆肥ARGs逐漸趨同.抗生素可能只是在堆肥初期對(duì)堆肥微生物產(chǎn)生影響,從而導(dǎo)致ARGs的差異.

圖6 環(huán)境因子與抗性基因冗余分析

3 結(jié)論

3.1 堆肥化處理林可霉素菌渣可以大幅降解林可霉素殘留,降解率為99%.

3.2 堆肥ARGs總豐度的增加可能是由于堆肥細(xì)菌生物數(shù)量增加所致.

3.3 林可霉素菌渣堆肥中1絕對(duì)和相對(duì)含量均急劇增加,表明堆肥過(guò)程中發(fā)生了整合子基因水平轉(zhuǎn)移,林可霉素菌渣堆肥存在環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn).

3.4 交互分析表明ARGs變化主要受環(huán)境因子影響,順序?yàn)閜H值>林可霉素殘留>溫度>C/N.

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Variations of Antibiotic resistance genes during lincomycin mycelia dreg composting.

REN Sheng-tao1, GUO Xia-li1, LU A-qian1, ZHANG Qian-qian1, GUO Xiao-ying1, WANG Yan1*, WANG Lian-zhong2, ZHANG Bao-bao2

(1.College of Chemical Engineering and Energy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China；2.Henan Xinxiang Hua Xing Pharmaceutical Factory, Xinxiang 453731, China)., 2018,38(11)：4276~4283

In order to investigate the variation of antibiotic resistance genes during the antibiotic mycelia dregs composting process, five antibiotic resistance genes (-01,1,,,) and one horizontal gene transfer (1) were detected from the compost by quantitative PCR technique. The results showed that 99% lincomycin was degraded after composting. For both the lincomycin mycelia dreg compost and sewage sludge compost, the absolute total of ARGs was all increased. By contrast, the relative total of ARGs were all decreased by 5% and 22% respectively.1 was enriched in lincomycin mycelia dreg compost indicating the potential ecological risk. The redundancy analysis revealed that the antibiotic resistance genes were greatly influenced by the environmental factors and the order was pH>licomycin residue>temperature>C/N.

composting；antibiotic；lincomycin mycelia dreg；fluorescence quantitative PCR；antibiotic resistance genes

X172

A

1000-6923(2018)11-4276-08

任省濤(1983-),男,河南濮陽(yáng)人,博士研究生,主要研究方向?yàn)樯锘?發(fā)表論文5篇.

2018-04-13

國(guó)家自然青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41601524);河南新鄉(xiāng)華星藥廠研究課題(20160140A)

* 責(zé)任作者, 教授, wangyan371@zzu.edu.cn