陳彩艷，唐文幫

（1.中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南 長沙410125；2.湖南農業(yè)大學農學院，湖南 長沙 410128）

隨著工業(yè)化的發(fā)展，我國土壤受鎘（Cd）、砷（As）等重金屬污染的面積逐步擴大。其中，鎘污染耕地超標位點為7.0%[1]。水稻是一種對鎘吸收能力較強的植物，低濃度的土壤鎘污染會導致稻米品質下降，高濃度的土壤鎘污染會導致水稻減產。推廣鎘低積累品種（variety）、全生育期淹水灌溉（irrigation）、酸性土壤pH值調增（pH）相結合的“VIP”技術體系是重金屬鎘污染超標農田治理的有效措施[2]。由于鎘低積累品種的效應不如水分管理和pH值調控的效應明顯，在相當長的時間里人們對低積累品種的研究與推廣工作并未引起足夠重視。但是，最近幾年的污染農田安全利用實踐表明，鎘低積累品種是鎘超標農田安全利用的必要條件。推廣低積累水稻品種既不增加水稻生產成本，又與現有的耕作制度無明顯沖突，因此其在整個鎘污染農田安全利用技術體系中的份量正在逐步加重。

1 鎘低積累品種的定義及其特征

1.1 鎘低積累水稻品種的定義

簡單地講，鎘低積累水稻品種就是在相同土壤環(huán)境條件下稻米鎘積累量相對較低的水稻品種。鎘低積累品種是一個相對的概念，由于稻米鎘積累受土壤環(huán)境和農藝措施的綜合調控，目前人們還沒有發(fā)現絕對的鎘低積累品種。結合鎘低積累品種的遺傳學和農學特征，這類品種在鎘高度污染的土壤中（有效態(tài)含量高）種植，稻米鎘積累量相對較低；在鎘中、輕度污染的土壤中種植，稻米鎘積累量可以達標；在鎘達標的土壤中種植，稻米鎘積累量不超標。當土壤鎘污染程度高時，稻米鎘不可能達標，這個時候基因型決定的表型差異變異能夠最大化，所以鎘低積累品種表型最明顯；中、輕度污染條件下，鎘低積累品種和高鎘品種稻米鎘積累量也能表現出差異，但差異相對較小，環(huán)境變異和栽培措施造成的差異有時會掩蓋基因型造成的差異，通過農藝措施調控可以實現稻米達標；達標土壤條件下，重金屬低積累品種的鎘低積累特性表現穩(wěn)定，不隨環(huán)境變化和栽培措施的改變和導致稻米鎘積累超標。當然，作物重金屬積累涉及到食品安全、生態(tài)修復、農學及遺傳學等多個領域，人們的知識背景不同，對重金屬低積累品種的界定也有不同標準。如在食品安全領域側重于強調低積累品種的農產品要符合國家安全標準，而在生態(tài)修復領域則側重于強調其吸收能力和富集系數要小于某一特定值。

表 1 糙米鎘含量與其他金屬元素間的相關性[2]Table 1 Correlations of grain Cd and other metal elements concentrations

1.2 鎘與其他重金屬的互作效應

鎘低積累品種中鎘與微量元素的關系是人們的一個重要關注點。作為一種非必需元素，鎘是伴隨生物體內其他必需元素的吸收和轉運而進入生物體內的。如鎘的吸收是通過NRAPM5，NRAMP1進行[3-4]，轉運由HMA2和LCT1等基因參與完成[5-6]，這些基因既能轉運鎘，也能轉運鋅和錳等其他必需元素。另外，在生產上施用一些必需元素制劑，如硅、鋅、鐵、錳等制劑也可能降低稻米的鎘積累量[7]。因此，人們擔心重金屬低積累品種在降低重金屬含量的同時會降低必需微量元素的含量，從而降低稻米的營養(yǎng)價值。我們研究了銅、鐵、鎂、錳、鎳、鉛和鋅等金屬元素與糙米鎘含量的相關性，發(fā)現除個別情況外，在田間鎘污染情況下生產出的稻米的鎘含量和這幾種元素間均無顯著相關性（表1）[2]，該結論與已有的遺傳學研究結果一致。從遺傳學的角度分析，目前還沒有一個已知的稻米鎘積累的QTL與這些必需元素含量的QTL區(qū)域重疊。因此，已有的證據不支持降低稻米鎘含量會導致營養(yǎng)元素含量下降的推斷。上述看似相互沖突的研究結果表明，目前已經發(fā)現的控制稻米鎘吸收、轉運的這些基因參與了稻米鎘積累的必要過程，但不是控制稻米鎘積累基因型差異的關鍵基因。我們最近的分子遺傳學研究也驗證了這一點，稻米鎘積累的品種間差異主要是OsHMA3的等位變異引起的。該基因定位在液泡膜上，專一性地將進入細胞質的鎘向液泡內轉運，阻滯鎘向地上部轉運，從而降低鎘在籽粒中累積。該基因的功能缺失突變會造成稻米高富集[8-11]。相對于多數粳稻品種的強等位基因型而言，多數秈稻品種具有一個弱等位基因型，因此秈稻的稻米鎘含量一般高于粳稻，而整合了粳稻相關等位基因的秈稻品種則積累較低的鎘。

1.3 稻米鎘積累與水稻生育期及產量的相關性

水稻的生育期越長，其產量會相對較高，同時其吸收并積累到體內的鎘會相對較多。因此人們憑直覺認為，稻米鎘積累與生育期及產量成正比。關于生育期和稻米鎘積累的相互關系，不同的學者得到不同的結論，這既可能與選用的材料有關，也可能與栽培措施（如水分管理）有關。最早認為鎘與生育期相關聯的遺傳學證據來源于日本科學家的稻米鎘積累QTL定位研究，其定位若干與鎘含量相關的QTL，但仔細分析發(fā)現這些QTL都位于已知的調控生育期的染色體區(qū)段內[12]。也就是說，稻米鎘積累的QTL位點和生育期控制位點可能存在連鎖累贅，或者屬于一因多效的同一位點。與之一致的是，我們實驗室也發(fā)現有低鎘基因與生育期基因存在連鎖累贅現象。但是，稻米鎘積累和生育期控制都是有多基因控制的數量性狀，個別基因的連鎖并不代表二者的性狀一定存在相關性。最近Sun[2]和Duan[13]分別調查了617個和471個品種的稻米鎘積累與生育期的關系。Sun利用全生育期干濕交替的方法排除水分管理模式干擾，在這種情況下，二者之間具有一定的相關性，但相關系數較低[2]。而Duan采用常規(guī)的水分管理模式，即中期曬田和成熟期斷水，結果發(fā)現稻米鎘積累量與生育期顯著正相關[13]。因此，稻米鎘積累量是否與生育期成正相關還需要更多的試驗數據支持。不過需要指出的是，即使生育期相同，稻米鎘積累量也有較大的差別，篩選和培育鎘低積累品種不受生育期和產量的限制。

1.4 鎘低積累水稻品種的類型及其遺傳力

雜交稻具有廣泛的雜種優(yōu)勢，其較高的肥水利用效率使人們直覺地認為雜交稻的稻米鎘含量也較常規(guī)稻高。因此，很多人認為重金屬低積累品種主要在常規(guī)稻中，而雜交稻的稻米鎘含量則相對較高，沒有鎘低積累品種。2014—2016年，我們以617份長江中下游主栽秈稻雜交稻品種、68份來源廣泛的常規(guī)稻品種為試驗材料，進行了稻米鎘含量的比較分析[2]?？傮w來看，雜交秈稻與常規(guī)秈稻亞群鎘含量無顯著差異（P＞0.05），與常規(guī)粳稻亞群鎘含量差異顯著（P＜0.01）。雜交稻與其親本間的籽粒鎘進行比較，未發(fā)現統(tǒng)一規(guī)律，既存在雜交稻比其親本（父本）稻米鎘含量高的品種，也存在低的或相差不大的品種，表明雜交稻稻米鎘含量不一定比親本高。在比較雜交稻籽粒鎘含量與常規(guī)稻各亞群及不同生態(tài)型籽粒鎘含量的差異時，我們發(fā)現雜交秈稻群體籽粒鎘含量與秈稻亞群相近。因此，鎘低積累品種的篩選培育與品種類型無關，而主要是其遺傳背景決定的。

根據雙因素方差分析，以水稻基因型和大田土壤污染作為兩個參考因素，我們分析了87份材料在4個不同污染大田中稻米鎘含量表型變異，發(fā)現相對于水稻基因型，大田土壤污染是決定水稻稻米鎘含量的主要因素，占表型變異的61.4%，而基因型則只決定了表型變異的16.5%。但是在相同的或相似的大田污染環(huán)境下，水稻稻米鎘含量變異則主要受其基因型的控制，達到極顯著水平（4個土壤污染環(huán)境下P＜0.001）。這說明，在不同的污染環(huán)境下，水稻稻米鎘含量主要由環(huán)境決定，而在相同或相似的污染環(huán)境下，水稻基因型決定了稻米鎘含量表型的變異。

2 鎘低積累品種的篩選認定方法

由于目前篩選和認定重金屬低積累品種的方法較多，如排序法，分級法，富集系數法等，人們對鎘低積累品種的篩選、認定還沒有形成統(tǒng)一的標準。各種方法都有一定的合理性，但也有不少爭論。主要爭議在于：1）沒有對照品種，2）基因型差異最大化與國家稻米鎘安全標準限值的矛盾。從篩選最終目標來說，我們篩選重金屬低積累品種是稻米鎘積累量相對較低，在一定條件下能達到國家安全限值標準的品種。但是稻米鎘積累量隨環(huán)境變化而變化，是一個連續(xù)的動態(tài)變化的正態(tài)分布曲線。與硬質小麥鎘低積累品種的表現類似（圖1A），當稻米鎘積累量總體較大時，基因型差異則較大。隨著整體稻米鎘積累量的降低，稻米鎘積累基因型差異也會減少，并且環(huán)境變化導致的差異會掩蓋基因型差異（圖1B、圖1C）。無論安全標準是0.2 mg/kg還是0.4 mg/kg，都是一個人為的限量標準，而水稻作為一個生物體并不認識這樣一個標準。隨著土壤水分、pH值、土壤理化性質等環(huán)境條件的變化，土壤有效態(tài)鎘會隨之變化，從而最終改變稻米鎘的積累量。因此，在鎘低積累品種篩選和認定時要求一次實驗既能分辨出各品種鎘積累量基因型差異，又要確保目標品種的稻米鎘積累量不超標是一件非常困難的事情。因此，我們建議根據稻米鎘積累基因型差異的特點，以目前表現穩(wěn)定的鎘低積累品種為對照，先在較高的鎘污染土壤條件下篩選出鎘積累量相對較低的品種，然后在較低鎘背景下評價其超標頻率，明確其安全生產所需的環(huán)境條件，最終認定高鎘污染條件下稻米鎘含量相對較低、中低鎘污染條件下能達標、而達標土壤條件下不超標、多重環(huán)境條件下表現穩(wěn)定的低積累品種作為鎘低積累品種。

圖 1 鎘高、低積累品種或近等基因系在不同土壤鎘濃度條件下的籽粒鎘積累差異Fig. 1 Grain-Cd concentrations varied according to soil-Cd level

3 篩選的鎘低積累品種

稻米鎘積累具有廣泛的基因型差異，品種不同，其對鎘的吸收，轉運和分配能力會有差異，因此利用稻米鎘積累的基因型差異，從已有的稻種資源中篩選鎘低積累品種是生態(tài)學家和生物學家的首要選擇[9-12]。由于鎘低積累品種篩選過程耗時較長，加上水稻品種更新較快，所以雖然鎘低積累品種篩選的研究報告較多，但商業(yè)化應用的還很少。目前只有個別突變體和湖南推薦的應急性鎘低積累品種在重金屬污染農田治理實踐中得到應用。

水稻鎘吸收主要通過錳離子轉運蛋白NRAMP5進行，Ishikawa等[12]利用碳離子束輻射誘變（Carbon ion-beam irradiation）越光（Koshihikari）獲得3株NRAMP5基因突變體，這三個突變體稻米鎘含量在鎘污染條件下顯著降低（0.05 mg/kg VS 1.73 mg/kg），其中兩株在農藝性狀和經濟產量指標方面沒有明顯的差異[14]。最近，Tang等[15]也獲得了該基因在華占等背景下的基因敲除突變體，考種數據表明該基因能夠降低鎘含量，對農藝性狀和除錳以外的其他微量元素的含量影響不明顯[15]。但是，NRAMP5是水稻吸收錳的主要通道，這些突變體的錳含量也顯著降低。由于錳是必需元素，該基因在中花11背景下突變體的生長發(fā)育受阻，生物量和籽粒產量顯著降低[3]，因此，敲除該基因是否會造成農藝表型方面的變化需要更為廣泛的試驗驗證。如果最終證明某些水稻材料能耐受較低水平的錳，或者這些材料的NRAMP5敲除后，另外的一些基因能代償性的增加錳的吸收而不增加鎘的吸收量，則可以通過基因工程手段改造NRAMP5來大幅降低土壤鎘污染帶來的稻米鎘超標風險。另外，還有兩個有望成為低鎘育種材料的突變體是lct1和lcd突變體[5,16]。LCT1（Low-affinity cation transporter 1）在膨大的維管束和散生維管束中表達，將葉片和莖節(jié)中的鎘向籽粒轉運。RNAi干擾表達后該植株的鎘含量能降低到原來的一半，但農藝性狀和其他微量元素含量沒有變化[5]。lcd是一個水稻Tos17插入突變體，該基因突變后即能增加水稻對鎘的抗性，也能減少稻米的鎘含量[16]。這兩個基因的突變體都有望整合到主栽品種中用于鎘低積累品種培育，但它們實際效應的大小還有待于更廣泛研究。

從2014年開始，湖南開始大規(guī)模篩選低鎘主栽品種，通過多年、多點、多重復的大田試驗及盆栽試驗，先后從685個主栽品種中篩選出了49個鎘積累相對較低的品種作為應急性鎘低積累品種。這些低積累品種兩年內在安全利用區(qū)推廣應用累計達40萬hm2（表2）)。另外，2017年Duan等[13]面向全國推薦了8個鎘低積累品種。上述品種都是目前市場占有率較高的品種，很多具有高產、高抗、優(yōu)質、低鎘的特性。這些品種有很多共性：早稻主要是株兩優(yōu)系列，共9個；中稻C兩優(yōu)系列和Y兩優(yōu)系列各4個，深兩優(yōu)系列3個；晚稻C兩優(yōu)系列6個，深優(yōu)系列和金優(yōu)系列各3個，H優(yōu)系列2個。追溯篩選出的鎘低積累水稻品種母本的共同來源發(fā)現，三系不育系主要來源于菲改B，兩系不育系主要來源于株1S和培矮64S；父本來源較廣，其中與三個以上品種有親緣關系的親本有：蜀恢527（12個品種）、先恢207（4個品種）、明恢63（4個品種）、岳恢9113（4個品種）、綿恢725（3個品種）、豐優(yōu)早11（3個品種）。這些共同來源親本，可能是水稻低鎘基因的來源，在育種和低鎘基因資源挖掘方面具有重要價值。

表2 篩選界定的鎘低積累水稻品種名錄Table 2 The list of low-Cd mega-rice variety

4 低累積水稻品種的定向培育

4.1 兩個低累積作物品種選育的成功案例

稻米鎘超標是最近才引起關注的現象，以往水稻育種家并不關注稻米重金屬含量這一性狀，所以目前很少有低鎘水稻品種定向培育的成果報道。但是，水稻并不是第一個遭遇品質危機的作物，低鎘向日葵和低鎘硬質小麥的培育過程或許可以為鎘低積累水稻品種定向培育提供借鑒經驗[17]。1992年，德國制定了0.6 mg/kg的向日葵鎘含量標準，這使得產自美國North Dakota州和Minnesota州的食用型葵花籽達不到安全條件。這兩個州的土壤是細沙壤土，排水不暢，含有較多的氯離子，因此鎘的有效性較高，產出的食用葵花籽的鎘平均含量為1.33 mg/kg。Li等[18]通過對200份種質資源的篩選（1994年），篩選出了2個鎘低積累品種Primrose和HA290，及兩個鎘含量中等的保持系HA323和恢復系RHA324。通過篩選HA323/HA290的后代，篩選出兩個低鎘新品種HA448和HA449。從RHA324/Primrose的后代中篩選出了RHA450恢復系。HA448/RHA450和HA449/RHA450 雜交種在2000—2002年三年實驗中的平均鎘含量降低50%以上[19]。硬質小麥比普通小麥累積更多的鎘。加拿大于1991年啟動了低鎘硬質小麥育種計劃。在最初的資源調查中發(fā)現了Hercules及其衍生品種Arcola的籽粒鎘含量相對較低，其中Arcola的鎘含量只有當時的主推品種Kyle的一半[17]。隨后的遺傳學研究發(fā)現籽粒中的鎘含量受到一對低鎘顯性基因的調控，并被定位到5B染色體上[20]。通過回交育種的辦法將該低鎘位點導入到5個高產品種中，這些近等基因系除了鎘能降低2.5倍外沒有其他差異。近等基因系間的差異大小隨環(huán)境的變化而變化，當整體籽粒鎘含量相對較低時二者差異相對較小，反之則較大（圖1）[21]。2004年世界上第一個商業(yè)化推廣的低鎘硬質小麥品種“Strongfield” 獲得認定[22]，其現在的推廣面積已經達到加拿大25%以上的硬質小麥種植區(qū)?，F在加拿大新審定推廣的硬質小麥必須具有低鎘特性[17]。

4.2 低累積水稻品種定向培育的階段性成果

從2014年開始，我國湖南啟動了鎘低積累水稻育種計劃，幾乎湖南所有與育種相關的單位都參與到這一過程。由于稻米鎘積累的性狀不能直接進行田間鑒定，且受環(huán)境影響較大，各參與單位所取得的進展并不一致。但總體而言，該育種計劃已經獲得初步成功，目前已有一大批高產、低鎘新品系和新組合正在參與品種預試和區(qū)試，鎘低積累品種板倉粳糯通過了品種審定（湘審稻20170012）。經驗表明，結合重金屬積累遺傳調控方面的基礎研究成果、育種家的育種經驗以及種業(yè)公司的商業(yè)化育種平臺能夠快速推進鎘低積累品種定向培育工作。分子育種手段具有一定的優(yōu)勢，其可以節(jié)約篩選成本，提高篩選效率。我們利用自己開發(fā)的4個低鎘分子標記，對已經定型的5 769份具有秈粳雜交背景的父母本新品系進行分子標記輔助選擇，篩選到攜帶1-3個低鎘分子標記的464S、141S等8份兩系不育系和R772、R051等72份父本新品系。2015年從72份父本材料中選取代表性的新品系14份參加多點鎘積累特性聯合鑒定試驗，其結果是目標選育品種的稻米鎘含量在整體參測品種中表現良好，低中更低。表3為部分品系的綜合表現，從中可以看出，這些品種已經具有了高產、高抗、質優(yōu)、低鎘的特征。由于雜交組合的鎘積累受雙親遺傳控制，以加性效應為主[23]，這些新品系配置的組合也表現出穩(wěn)定的低鎘特征（表3）。

表3 新育成的代表性低鎘恢復系及組合的田間表現Table 3 performance of newly-developed low-Cd restorer lines and their combinations

5 展望

治理土壤重金屬污染是一項長期艱巨的任務，推廣鎘低積累水稻品種能有效降低稻米鎘超標的風險。篩選和培育出一批低鎘、高產、高抗、優(yōu)質的主栽品種是育種家和農業(yè)環(huán)境保護工作者長期努力的目標。低鎘基因挖掘和種質創(chuàng)新、低鎘新品種培育與認定、鎘低積累品種分級及生態(tài)適應性區(qū)間劃分是今后一段時間的工作重點。

低鎘基因挖掘和種質創(chuàng)新是鎘低積累水稻育種的基礎，需要利用自然群體和人工創(chuàng)制的遺傳群體，開展全基因組關聯分析和基因定位研究，尋找低鎘基因資源及其緊密連鎖的分子標記。在此基礎上進一步精細定位和克隆低鎘功能基因。解析主栽品種中相關功能基因的等位變異規(guī)律，篩選優(yōu)異等位基因變異，開發(fā)功能性低鎘分子標記。建立鎘低積累水稻分子輔助育種技術體系，有效提高鎘低積累水稻新品種選育效率。將篩選到的低鎘基因，利用雜交、回交育種手段和MAS育種技術聚合到有價值的育種資源中；利用分子標記技術，直接從農藝性狀穩(wěn)定的鎘低積累材料中篩選含有已知低鎘基因的新材料；對篩選獲得的鎘低積累材料進行多年多點的鎘積累特性鑒定和其他農藝性狀評價，獲得具有育種應用潛力的穩(wěn)定低鎘材料。

低鎘新品種培育與認定是鎘低積累水稻育種的核心。低鎘新品種培育可以通過三種途徑實現，即定向改良高產高鎘品種、定向改良低鎘低產品種、低鎘高產雜交組合后代篩選。高產高鎘品種改良是將低鎘積累等位基因轉育到現有高產高鎘骨干親本中，培育常規(guī)稻新品系、雜交稻新組合。而低鎘低產品種改良是將控制產量性狀的基因Gn1a、Ghd7、RH8[24-26]的優(yōu)秀等位基因型定向聚合到低鎘目標品種中，篩選高產、鎘低積累水稻新品種。低鎘、高產雜交組合后代篩選是結合傳統(tǒng)的田間鑒定和分子標記，從高產低鎘雜交后代中篩選穩(wěn)定的目標株系。通過多年多點的鎘積累特性鑒定和其他農藝性狀評價，最終選育低鎘、優(yōu)質、多抗、高產、廣適型新品種，區(qū)試產量、品質和抗性指標符合現行品種審定要求，稻米鎘超標風險顯著降低。

稻米鎘積累受環(huán)境因子和遺傳因子的共同影響，每一鎘低積累品種都有獨特的遺傳特點，因此，它們的生態(tài)適應性區(qū)間也各有不同。建立鎘低積累品種分級體系及明確各品種生態(tài)適應性區(qū)間（土壤鎘濃度，pH值等）是鎘低積累品種選育的難點。如何對鎘低積累品種進行精準表現鑒定，建立一套簡單易行、可操作性強、穩(wěn)定可重復的水稻鎘積累特性表型鑒定標準與分級評價體系，確立低鎘新品種審定的地方標準或國家標準是低鎘育種必須跨過的門檻。