欒英橋 楊佳幸 陶嫦立 邵紅偉 張文峰

(廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院/廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室，廣州510006)

腸道微生物是腸道微環(huán)境的主要構(gòu)成部分，是動物體內(nèi)復(fù)雜且重要的微生態(tài)系統(tǒng)。正常宿主腸道內(nèi)定植的微生物包含上千種，其中以擬桿菌門與厚壁菌門豐度最高，占腸道微生物總量的90%以上[1]。這些與宿主建立共生關(guān)系的微生物能影響多種生理功能，Chevalier等[2]研究發(fā)現(xiàn)，冷暴露能導致腸道微生物組成顯著變化，將變化的菌群移植到無菌小鼠體內(nèi)，可以增加宿主對胰島素的敏感性。菌群通過促進宿主白色脂肪褐變使其具有耐寒能力，但也導致機體能量損失及脂肪損失增加。近年來的研究表明，腸道微生物的穩(wěn)態(tài)對于調(diào)節(jié)宿主免疫的發(fā)育，維持機體正常免疫機能有不可或缺的作用。Lebalnc等[3]研究發(fā)現(xiàn)，灌胃母鼠含干酪乳桿菌的益生乳，可以改變母鼠及其后代的腸道菌組成，并且經(jīng)益生乳灌胃的母鼠哺育的后代，其腸液中SIgA含量增加，腸道內(nèi)巨噬細胞、樹突狀細胞與IgA+細胞比例增加。腸道微生物在宿主體內(nèi)行使重要的功能，因此越發(fā)成為研究的熱點。腸道是機體免疫防御的一道重要防線，腸道適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在病原體入侵后發(fā)揮重大作用。其主要組成部分是腸有關(guān)淋巴樣組織，包括派伊爾結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)等次級淋巴組織，及腸固有層和腸黏膜上皮內(nèi)的淋巴細胞[4]。派伊爾結(jié)內(nèi)的B細胞在T細胞刺激后分化成分泌SIgA的漿細胞，SIgA對保護腸道屏障完整性具有重要作用[5]。初始T淋巴細胞在抗原刺激后分化成不同的亞群，這些細胞在特異性細胞因子的調(diào)控下，行使不同的免疫功能。如TH細胞在IL-23、IL-1β、TGF-β的誘導下分化成TH17細胞，后者與腸道內(nèi)某些炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。腸道淋巴細胞的穩(wěn)態(tài)對平衡炎癥反應(yīng)與免疫耐受至關(guān)重要。本文將從腸道微生物對腸道B淋巴細胞、T淋巴細胞免疫應(yīng)答的影響展開討論。

1 腸道菌群對腸道B淋巴細胞應(yīng)答及IgA分泌的影響

黏膜免疫球蛋白A(Immunoglobulin A，IgA)作為一種B細胞在腸內(nèi)分泌的功能蛋白，可跨越腸道上皮屏障，與腸道微生物、腸內(nèi)抗原相結(jié)合，使其不能與宿主腸道直接接觸。該過程避免了腸腔內(nèi)容物對黏膜免疫系統(tǒng)潛在的有害刺激。Peterson等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在IgA缺乏的模型中，腸內(nèi)共生的多形擬桿菌異常表達的產(chǎn)物能參與炎癥反應(yīng)，并在宿主體內(nèi)誘發(fā)促炎信號。IgA可以通過體細胞超變過程進一步親和性成熟，高親和性的IgA選擇性地與腸道微生物的組成成分結(jié)合[7]，該過程改變腸內(nèi)菌群的組成并更好地促進宿主與腸道菌群的互惠共生關(guān)系。

1.1腸道菌群對T細胞依賴型B細胞的影響 在哺乳動物腸道內(nèi)，根據(jù)抗體分泌過程的不同，B細胞可分為兩種類型，一種是依賴T細胞模式分泌抗體的B2細胞，另一種是非依賴T細胞模式分泌抗體的B1細胞[8]。腸道免疫細胞通過能識別PAMPs的模式識別受體(PRRs)與入侵性腸道菌發(fā)生作用。細菌侵入到腸道內(nèi)部黏液層并在上皮細胞附近定植，定植菌群可被上皮M細胞捕獲，誘導高親和性T細胞依賴模式的IgA應(yīng)答。

以往研究發(fā)現(xiàn)，MyD88參與包括TLRs在內(nèi)的多種細胞因子受體的功能發(fā)育過程。如圖1所示，TLRs一般在巨噬細胞及樹突細胞表面表達，Gribar等[9]發(fā)現(xiàn)腸道上皮細胞高豐度表達TLRs，TLRs參與上皮細胞與細菌表面TLRs配體的互作過程。Kubinak等[10]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性受體MyD88參與腸道內(nèi)TFH細胞及IgA+B細胞發(fā)育的過程。Myd88分子通過影響TLRs功能，間接參與TFH細胞的分化。

圖1 腸道B1細胞IgA分泌過程Fig.1 IgA secretion progress of B1 cell

TFH細胞釋放CD40配體和白介素-21誘導B細胞活化，活化后的B細胞上調(diào)表達CCR6，并在CCL20的趨化作用下向腸內(nèi)上皮穹頂轉(zhuǎn)移[11]。同時，B細胞表達更高水平的AID+，后者參與促進IgA類別轉(zhuǎn)換重組[12]。DCs作為腸內(nèi)重要的抗原呈遞細胞，受到上皮M細胞呈遞的抗原刺激，并在ICL3s釋放的LT-α及LT-β的誘導下，分化為CD11b+DCs并與受趨化的B細胞相互作用。CD11b+DCs在與B細胞的作用過程中，進一步促進TGF-β的產(chǎn)生。在TGF-β的作用下，B細胞遷移并進一步進入生發(fā)中心反應(yīng)[11]，分泌高親和性的IgA以適應(yīng)腸道微生物改變。Lindner等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當菌群復(fù)雜性增加時，IgA譜也相應(yīng)增加。這種適應(yīng)性過程主要依賴于B細胞進入生發(fā)中心后的進一步成熟及腸道漿細胞池內(nèi)B細胞的體細胞超變過程。腸道菌作為腸道內(nèi)重要的抗原之一，維護腸道正常免疫耐受，刺激腸內(nèi)B細胞成熟，參與腸道免疫蛋白免疫防御構(gòu)建，對維持腸道穩(wěn)態(tài)有重要作用。

1.2腸道菌群對非T細胞依賴型B細胞的影響 Bunker等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在T細胞功能缺陷的小鼠模型中，同樣存在針對腸道菌群的特異性IgA應(yīng)答。這說明非T細胞依賴的IgA應(yīng)答也與腸道菌群有密不可分的關(guān)系。在野生型或T細胞缺陷型鼠中都發(fā)現(xiàn)特異針對腸道菌的IgA應(yīng)答。

非T細胞依賴的IgA重組轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在腸道固有層。如圖2所示，固有層DCs受到抗原信號及來自ICL3s的協(xié)同刺激，釋放B細胞活化因子(BAFF)及其同源物APRIL，促進B細胞AID+誘導[15]。然而，包括針對腸道菌IgA抗體應(yīng)答在內(nèi)的大部分IgA應(yīng)答，都是通過體細胞突變過程獲得高親和性[16]。

圖2 腸道B2細胞IgA分泌過程Fig.2 IgA secretion progress of B2 cell

Wei等[17]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶AID的突變形式AIDG23S的小鼠具有正常量的IgA，但V區(qū)突變大大減少，導致生發(fā)中心在小腸中增生及細菌異常擴張。非T細胞依賴的IgA應(yīng)答能夠產(chǎn)生低親和性的IgA，但AID依賴性及TFH依賴性應(yīng)答對共生特異性IgA的數(shù)量及親和成熟做出重要貢獻。

2 腸道菌對維持腸道TH17細胞與Treg細胞穩(wěn)態(tài)的影響

T細胞表面受體受到先天免疫細胞釋放的特定信號因子刺激后，T細胞產(chǎn)生分化并被趨化到不同部位行使各異的功能。樹突狀細胞衍生的維生素D及視黃酸能誘導CCR10和CCR9，其趨化因子參與引導T細胞募集到皮膚及小腸[18,19]。腸道T細胞存于回腸末端的淋巴組織中，與回腸末端豐富的腸道微生物形成相對穩(wěn)定的微生態(tài)。腸道T細胞在不同的腸道菌及其他環(huán)境因子影響下，具有不同的促炎或抗炎的細胞表型。調(diào)節(jié)性T細胞作為一類具有抑制炎癥細胞作用的功能細胞，與TH17細胞等促炎細胞大量共存于腸道固有層，兩者的平衡對維持腸道穩(wěn)態(tài)十分重要。

2.1腸道菌群對腸道TH17細胞的影響 RORγt+TH17細胞富集于腸道固有層中，占已分化CD4+T細胞數(shù)量的30%～40%[20]。TH17細胞的標志性細胞因子，如IL-17A、IL-17F、IL-22等，可以促進腸上皮細胞分泌抗菌肽并對腸上皮細胞的緊密連接有促進作用[21]。然而，TH17細胞受到IL-23及IL-1β刺激后，轉(zhuǎn)變成一類具有致病作用的TH17細胞。致病性TH17細胞釋放如IFN-γ、CSF-2等促炎因子，對自身免疫病及部分炎癥均有惡化作用[22]。

腸道菌是影響TH17細胞分化的主要因素。以往研究發(fā)現(xiàn)，抗生素處理或無菌狀態(tài)會減少小鼠腸道內(nèi)TH17細胞數(shù)量[23]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，分節(jié)絲狀菌是腸道菌中誘導TH17細胞增殖分化的重要一環(huán)[24]。分節(jié)絲狀菌緊密連接于回腸末端的上皮細胞，分節(jié)絲狀菌與上皮細胞的接觸作用對TH17細胞分化是必不可少的。分節(jié)絲狀菌的定植誘導回腸末端上皮細胞內(nèi)兩種同工型的血清淀粉蛋白A的基因表達上調(diào)[25]。血清淀粉蛋白A在上皮細胞的表達依賴于ICL3分泌的IL-22的刺激，前者表達水平上調(diào)對IL-17A的誘導有促進作用。在前反饋過程中，CX3CR1陽性髓樣細胞響應(yīng)血清淀粉蛋白A，釋放細胞因子激活I(lǐng)CL3，促進TH17細胞分化[24]。血清淀粉蛋白A也可以直接刺激T細胞，促進RORγt陽性細胞表達并上調(diào)IL-17A水平[25]。Derebe等[26]發(fā)現(xiàn)，血清淀粉蛋白A是一種呈遞視黃醇和高密度脂蛋白的載體，可以通過呈遞免疫調(diào)節(jié)分子的途徑影響T細胞。

除腸道菌與腸道的接觸作用影響TH17細胞外，Deng等[27]研究發(fā)現(xiàn)，一種致病性的細菌相關(guān)微粒能刺激上皮細胞釋放高水平的CCL20及前列腺素E2，該類細胞因子對TH17細胞的募集和增殖有重要作用。Hall等[28]研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物DNA通過與Toll-like受體作用，參與TH17細胞增殖過程。TLR9缺陷型小鼠腸道內(nèi)TH17細胞數(shù)量相比正常小鼠顯著減少，在用腸道菌DNA處理后，腸道內(nèi)TH17細胞數(shù)量增加。此外，腸道菌趨化下產(chǎn)生的胞外ATP也是腸內(nèi)TH17細胞增殖的重要誘導因素。與SPF級小鼠相比，GF小鼠腸腔內(nèi)ATP含量降低且固有層TH17細胞數(shù)量減少[29,30]。Smith等[31]研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌釋放的脂肪酸能調(diào)節(jié)RORγt活性，從而控制穩(wěn)態(tài)TH17細胞與致病TH17細胞間的平衡。腸道菌作為影響腸道TH17細胞的重要調(diào)節(jié)樞紐，以多種途徑參與對腸道TH17細胞及相關(guān)細胞因子的有效調(diào)節(jié)，維護腸道免疫穩(wěn)態(tài)。

2.2腸道菌群對腸道Treg細胞的影響 腸道Treg細胞在維持腸道免疫耐受方面具有十分重要的作用。腸道固有層中的Treg細胞按來源可分為胸腺分化的Treg(tTreg)細胞和外周分化的Treg(pTreg)細胞[32]，pTreg細胞富集于結(jié)腸，Ohnmacht等[33]發(fā)現(xiàn)IL-10是RORγt+pTreg細胞的主要標志物之一，Treg細胞釋放的IL-10對抑制骨髓細胞、γδT細胞及TH17細胞的異常激活有不可或缺的作用[34,35]。Sefik等[32]發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道Foxp3+T細胞的RORγt表達失活致使腸道TH17細胞異常增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在無菌小鼠腸道內(nèi)不存在pTreg細胞，因此腸道pTreg細胞的發(fā)育可能與腸內(nèi)腸道菌有關(guān)。Mitsuoka等[36]將從普通小鼠糞便中分離得到的梭菌混合物灌胃給無菌小鼠，致使無菌小鼠結(jié)腸內(nèi)Treg細胞顯著增加。梭菌在腸內(nèi)定植后，促進腸道Treg細胞釋放IL-10和CTLA-4。同時，梭菌混合物的植入給Treg細胞提供了富集TGF-β的微環(huán)境，有利于誘導T細胞向Treg細胞分化。

研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌可能通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸的過程，參與誘導腸道Treg細胞。Furusawa等[37]研究發(fā)現(xiàn)，幼稚CD4+T細胞向pTreg分化的過程中HADCs處于抑制狀態(tài)，組蛋白H3 非編碼保守區(qū)的Foxp3位點脫乙?；?。Narushima等[38]分析誘導Treg增殖的梭菌基因組，預(yù)測到多個參與短鏈脂肪酸生物合成的基因。短鏈脂肪酸通過抑制組蛋白脫乙酰酶(HDACs)表達，抑制樹突細胞中的促炎細胞因子的釋放[39]。此外，體外實驗發(fā)現(xiàn)，利用短鏈脂肪酸刺激Treg細胞后，可表達高水平的GPR15，并促使Treg細胞向結(jié)腸募集[40]。因此，以上研究表明腸道菌是誘導腸道內(nèi)Treg細胞形成的重要因素，在不同環(huán)境因素下對免疫系統(tǒng)有不同的刺激，協(xié)調(diào)TH17細胞與Treg細胞數(shù)量，最大程度地避免腸道內(nèi)免疫失衡。

近年來，腸道菌群越發(fā)成為腸道免疫方向的重要關(guān)注點。從腸道菌及其代謝產(chǎn)物的角度，人們利用不同的動物模型，開發(fā)改進的疫苗及涉及免疫系統(tǒng)疾病治療的藥物。但是，腸道菌與宿主的相互作用受宿主遺傳因素、致病微生物與腸道菌的競爭關(guān)系及環(huán)境因素等多方面的影響。因此，人們需要開發(fā)除組學分析外的系統(tǒng)分析，提供進一步靶向有治療目的微生物群及宿主細胞成分的方法。